基于Box-Behnken响应面设计法结合熵权法优化秋水仙碱醇传递体的制备工艺*

柯寄明，江素萍，刘艳，严佳智，黄山，汪杰，彭灿，2，3，4，张继稳，5

(1.安徽中医药大学药学院，合肥 230012；2.药物制剂技术与应用安徽省重点实验室，合肥 230012；3.中药复方安徽省重点实验室，合肥 230012；4.安徽省中医药研究院，中药资源保护与开发研究所，合肥 230012；5.中国科学院上海药物研究所，上海 201203)

秋水仙碱(colchicine，COL)是一种生物碱，多年来一直用于治疗急性痛风[1]。但其首关代谢广泛、治疗指数较低[1-2]和口服生物利用度较差(25%～50%)[3]。此外，口服秋水仙碱会出现轻度至重度的胃肠道副作用，包括腹部绞痛和疼痛、恶心、呕吐和腹泻[4]。即使是在治疗剂量下，80%患者通常会发生这些副作用[5]。因此，经皮给药可能为秋水仙碱的给药方式提供一条新的途径，以解决口服秋水仙碱的剂量依赖性副作用和生物利用度差的问题。醇传递体(transethosomes，TEs)在经皮给药方面具备醇质体和传递体两种载体的优点[6]，能够包载亲水性或者疏水性的药物，许多研究已经证明TEs能够增强具有不同理化性质的药物的透皮给药效果[7-10]。TEs在醇质体的基础上加入表面活性剂，可以增加磷脂分子间的距离，干扰磷脂酞基链的顺序，从而增加醇传递体的流动性[11-12]；TEs在传递体的基础上加入乙醇，高浓度乙醇具有促渗作用[13]，乙醇也作为表面负电荷的供体，可以避免脂质囊泡的聚集，使整个体系更加稳定[14]。

Box-Behnken设计(BBD)是一种流行的配方和工艺优化工具，它利用实验空间边缘和中心中点的处理组合。与中心组合设计(CCD)，D-最优设计和3水平因子设计相比，BBD可以用更少的时间和更少的实验次数来优化处方，并且更具成本效益。此外，BBD没有轴向点，能够确保所有设计点都落在安全操作区域内[15-16]。熵权法(entropy weight method，EWM)则是对实验数据进行整理、计算和分析，从而得到各项实验指标的权重系数[17]。两者配合能够降低人为主观因素产生的实验结果偏差，从而使结果更加合理客观。

当采用BBD考察多个指标的时候，通常对单独指标逐个进行分析，或者人为主观地给不同的指标赋权，避免不了主观因素的介入。因此为优化COL-TEs的处方，采用BBD和EWM进行统计学优化，旨在筛选出COL-TEs的最优处方，为同类型制剂的处方筛选提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 高效液相色谱仪(THERMO V3000型，赛默飞世尔科技公司)；高速离心机 (BT-25S型，常州市万丰仪器制造有限公司)；十万分之一电子分析天平[AB135-S型，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；集热式恒温加热磁力搅拌器 (DF-101S型，巩义市予华仪器制造有限责任公司)；激光粒径仪(3000HS型，英国Malvern公司)；透射电镜(JEM-2100型，日本EILL公司)；超声细胞破碎仪(SFX型，美国艾默生公司)。

1.2药品与试剂 秋水仙碱 (COL，西安山川生物技术有限公司，批号：101176-201001，含量：98%)；大豆卵磷脂 (上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：K1915226，含量>98%)；脱氧胆酸钠 (上海麦克林生化科技股份有限公司，批号：C11584234，含量：98%)；乙醇 (色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；甲醇 (色谱纯，Fisher公司)；超纯水。

2 方法与结果

2.1秋水仙碱含量测定

2.1.1色谱条件 Unitaryl C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(60：40) ；柱温：30 ℃；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL[18]。

2.1.2标准曲线的绘制 精密称取COL对照品5 mg，置于10 mL量瓶内，用甲醇配制COL对照品储备液(500 μg·mL-1)。依次加入甲醇稀释到浓度为1.00，2.00，5.00，10.00，20.00，50.00，100.0，200.0，500.0 μg·mL-1的一系列COL对照品溶液。以浓度(X)对峰面积(Y)进行线性回归，线性方程为Y=0.601 6X-0.115 9(R2=0.999 7)。该结果表明在1～500 μg·mL-1浓度范围内峰面积和浓度呈良好的线性关系。日内精密度RSD为0.29%，日间精密度RSD为0.08%，平均回收率为(98.87±0.11)%，符合含量测定要求。

2.2COL-TEs的制备 精密称取适量大豆卵磷脂，脱氧胆酸钠于4 mL乙醇中，混合置于锥形瓶当中，加热溶解。将10 mg的COL加入到水6 mL中形成水相，用注射器将含有COL的水相缓慢注入到锥形瓶中，保持50 ℃恒温，1300 r·min-1搅拌30 min，探头超声(超声5 s，停5 s，振幅25%，5 min)，过筛孔内径0.22 μm滤膜即得。

2.3包封率测定

2.3.1方法回收率 精密制备低、中、高浓度(0.1，0.5，1.0 mg·mL-1)的COL溶液，分别取适量于超滤管中离心(4000 r·min-1，30 min)，收集续滤液，将超滤前后药物溶液进样分析，计算游离药物回收率。COL的回收率>95%，符合要求，见表1。

表1 COL的回收实验结果

2.3.2加样回收率 精密取COL适量加至空白醇传递体中，使COL的浓度分别为0.1，0.5，1.0 mg·mL-1，分别取适量于超滤管中离心(4000 r·min-1，30 min)，收集续滤液，将超滤前后药物溶液进样分析，计算回收率。COL的加样回收率>95%，符合醇传递体包封率测定方法的要求，见表2。

表2 加空白醇传递体后COL的回收率

2.3.3包封率测定方法 精密量取COL-TEs适量置于超滤离心管中，离心(4000 r·min-1，30 min)后取外管液体用甲醇定容至10 mL，按“2.1.1”项色谱条件测定秋水仙碱含量记为W1。取同体积COL-TEs甲醇定容至10 mL，超声破乳，按“2.1.1”项色谱条件测定秋水仙碱含量记为W2。计算包封率，包封率(%)=(W2-W1)/W2×100。

2.4粒径、PDI和Zeta电位测定 移取适量COL-TEs到样品池中，利用激光粒径仪对其进行粒径、分散系数(PDI)和Zeta电位的检测。

2.5工艺优化

2.5.1因素水平表的确定 根据预实验结果，确定温度为50 ℃，转速为1300 r·min-1，搅拌时间为30 min。选择对实验影响较大的因素进行BBD优化。以卵磷脂用量(A)、脱氧胆酸钠用量(B)、乙醇体积(C)为考察因素，以粒径、PDI、Zeta电位和包封率为指标，采用BBD对COL-TEs处方进行优化，因素水平见表3。

表3 因素和水平设计

2.5.2信息熵法对数据的分析 信息论里，度量不确定性用熵表示。为了消除人为因素的影响，在确定评价指标权重时采用了客观熵权法。运用熵权法，将每个评价指标视为一个随机变量，计算该指标的熵权系数，其取值变异程度越大，越无序，信息量提供的就越多，该指标就越重要；反之亦然。因此，熵权法是更为客观的一种赋权法[19-20]。用熵权法分配权重的计算步骤如下。

①指标归一化处理：设m个评价指标n个评价对象的原始数据矩阵为X=(aij)mn，对其归一化后得到X'=(xij)mn，对正向指标而言，用以下公式进行归一化。

X'ij=(aij-minj{aij{)/maxj{aij}-minj {aij})，X'ij表示第 i 次实验时第j个评价指标的取值，i=1，2，3，…，m；j=1，2，3，…，n。

②将原始数据阵(aij)mn转换为概率矩阵(Pij)mn；在信息熵公式中 Pi 为某个信息的概率，满足0≤Pi≤1，因此必须先对矩阵(aij)mn做归一化处理，经处理后的矩阵可视为评价指标的概率矩阵。其中Pij表示第j次实验在第i个评价指标下的概率。

③计算指标的熵值，确定第i个评价指标的信息熵(Hi)。

④计算指标的熵权系数(Wj)。

经过计算，得到各指标熵值和权重系数，见表4。

表4 各指标熵值及权重系数

2.5.3实验安排 根据因素水平表，选择优化方法，根据实验随机安排进行优化实验。运用Design-Expert软件对数据进行二次多元回归拟合分析，得到卵磷脂用量(A)、脱氧胆酸钠用量(B)、乙醇体积(C)与综合评分(Y)之间的模型方程。对综合评分值模型进行方差分析。

BBD的方案及综合评分的结果见表5。利用软件对表5中数据进行二次多元回归拟合分析，得到A、B、C与Y之间的二次多元回归模型方程：Y=0.041 610 6+0.010 574 1A+0.007 182 37B+0.010 803 1C-0.003 834 08AB+0.012 226 4AC+0.006 103 34A2+0.003 906 19B2+0.026 567 9C2，以综合评分值模型进行方差分析，方程决定系数，R2=0.780 1。

表5 BBD-响应面实验的设计与结果

方差分析结果见表6。模型的P<0.05，可信度高，失拟项不显著，说明该模型拟合度较好且差异有统计学意义，可以对不同条件下的目标指标进行预测，因此该模型可用于处方的筛选与预测。

表6 方差分析结果

2.5.4效应面优化 根据拟合的模型，采用Design-Expert软件生成综合评分值随因素变化的三维曲面图和等高线图。等高线图和三维图能够预测和检验各因素与综合评分之间的关系。由图1可知，AB、AC的等高线呈椭圆形，说明卵磷脂和脱氧胆酸钠、卵磷脂和乙醇两者之间的交互作用明显，说明AB、AC的交互作用对综合评分影响较大。

图1 不同因素对综合评分值影响的等高线图与响应面图

2.5.5COL-TEs最优处方的验证 结合二次回归方程，求解得到最佳处方为卵磷脂500 mg，脱氧胆酸钠50 mg，乙醇4 mL(综合评分预测值0.115)。在该工艺下平行实验3次，测定指标包封率、电位、PDI和粒径，见图2和图3。实测包封率分别是60.99%，60.6%，59.12%；粒径分别是151，112.8，116.7 nm；Zeta电位分别是-14.5，-16，-16.9 mV；PDI分别是0.205，0.211，0.262。对应的综合评分分别是0.106 2，0.108 8和0.107 4，与预测值的RSD为3.39%，证明该工艺稳定可靠。

图2 COL-TEs的粒径分布图

图3 COL-TEs的Zeta电位图

2.5.6COL-TEs形态考察 吸取适量最优处方样品滴于铜网上，10 min后用滤纸沿边缘吸干，然后用2%磷钨酸进行染色，放置6 min，待其风干后，用透射电镜观察最优处方下COL-TEs的形态，见图4，可以看出，最优处方下的COL-TEs呈类球形，且互相没有粘附，分布均匀，大小均一，说明制得的最优处方分散性良好。

图4 COL-TEs的透射电镜图

3 讨论

秋水仙碱既可以溶于水也可以溶于乙醇，所以测定包封率的时候用超滤离心管进行测定，避免分离方法对测定结果的影响[21]。由于秋水仙碱的溶解性，导致其在脂质载体中的包封率不高[22]，所以本研究除了将COL-TEs的一些基础的表征(粒径、电位和PDI)作为考察指标，同时也将包封率作为研究指标。当同时选取多个指标的时候，需要单独对每个指标进行分析，无法避免人为主观因素的介入[23]。有研究用主观赋权的方法将2个指标分配权重，得到一个综合评分，从而进行处方的筛选[24]。但当考察因素超过2个时，这样的赋权方式不客观。本文为了避免人为因素的影响，利用客观熵权法获得评价指标的权重。该法可以根据每个指标的熵权系数的取值变异程度来判断指标的重要程度。经过其处理，包封率的权重最大，电位次之，粒径和PDI相差不大，说明实验得出包封率的结果变异程度高，是4个指标中最重要的指标，粒径和PDI随考察因素的改变而变化不大，所以分配的权重不高。利用个人经验赋权常常会使实验结果出现偏差，运用熵权法计算各指标的权重，结果更合理可靠。根据拟合方程优选工艺条件，由此制备的COL-TEs测量值与预测值偏差较小，相关性好，BBD结合熵权法为筛选出最优的处方提供了可靠的数据。优化后所制得的COL-TEs大小均一，分布均匀，电位稳定，包封率优于主动载药的秋水仙碱脂质体[25]和醇质体[26]，满足用于透皮给药TEs的要求。目前，国内使用Box-Behnken响应面设计法结合熵权法多用于中药提取工艺[27]和提取物干燥工艺优化[28-29]。基于此，BBD结合熵权法可以为同类型的制剂处方筛选提供参考依据，适合需要考察多个指标的制备工艺的选择。