不同检测系统测定结直肠癌肿瘤标志物CA242结果的一致性分析

雷燕，胡帅，王黎，卢小岚

(1.川北医学院附属医院检验科；川北医学院，2.医学检验系；3.转化医学研究中心，四川 南充 637000)

随着现代生活水平的提高和生活方式的改变，2019年国际研究[1-2]结果显示，1990年至2017年，全球胰腺癌和结直肠癌的发病率分别增加了12%和10%，胰腺癌死亡率均增加了10%。结直肠癌成为导致癌症死亡的全球第二大主要原因，仅次于肺癌。早期增加肿瘤标志物的筛查干预措施可在一定程度上减少对结直肠癌、胰腺癌等消化道肿瘤的误诊和延迟治疗。

糖类抗原242(carbohydrate antigen 242,CA242)由人结直肠癌细胞COL0205免疫小鼠与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0融合获得，是一种唾液酸化的糖脂类抗原，可作为新型糖类肿瘤标志物[1-2]；在正常人的胆管细胞、胰管细胞中含少量CA242；而在胰腺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌和胆管细胞癌等恶性肿瘤中呈高表达，可用于此类肿瘤的诊断和病情监测[3-7]。因此采用灵敏和可靠的检测技术检测CA242，将为早期发现和预防消化道恶性肿瘤提供新思路。

目前临床检测CA242的方法主要有酶联免疫吸附法、化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)、蛋白芯片法及流式荧光免疫分析等[8-10]。相比其他方法，CLIA法具有准确性好、敏感度高、稳定性高、检测快速且易于自动化等优点，逐渐成为CA242的主要检测方法。但是不同厂家、不同试剂盒测定有差异，导致血清CA242测定结果仍有较大差异。为积极响应国家对国产仪器的研发、转化与应用，探讨不同国产检测系统之间CA242的检测结果的差异和一致性具有一定的前瞻性。本研究以深圳新产业(Snibe)的检测系统为参考检测系统、天津博奥赛斯(Bioscience)检测系统为检测系统，对两种检测系统测定血清CA242结果的一致性进行评估。

1 资料与方法

1.1 一般资料

根据2017.V1版《NCCN结直肠癌诊治指南》中规定的诊断标准[11]，选取2019年6月至2019年12月川北医学院附属医院收治并诊断为结直肠癌的61例患者作为结直肠癌人群组。所有患者中，男性54例，女性48例；年龄(53.9±11.2)岁；结肠癌22例，直肠癌39例。所有患者均排除有严重的脏器(心、肺、肝、肾等)功能不全者、严重的感染性疾病者、以及合并其它严重肿瘤者等。选取同期106名进行健康体检的健康人群作为健康人群组，其中男性55例，女性51例；年龄(52.5±10.7)岁。所有研究对象均经体格检查、实验室检查排除肿瘤等其他疾病。两组研究对象一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 试剂与仪器

深圳新产业生物医学公司(Snibe)MAGLUMI 2000全自动化学发光检测系统及CA242配套检测试剂为参考比对检测系统，试剂盒批号为(LOT：06121011)。采用天津博奥赛斯生物科技有限公司(Bioscience)的Axceed 260全自动化学发光检测系统及其配套CA242检测试剂为待比检测系统，试剂盒批号为(LOT：G201910013)。采用天津Bioscience公司质控品(LOT：G19091105)，低、高质控标示值分别为20 U/mL、100 U/mL。

1.3 方法

1.3.1 精密度评价 参考美国临床实验室标准化委员会(National committee for clinical laboratory，NCCLS)EP15-A2文件[12]的要求进行，分别采用低、高浓度样本分别在Bioscience系统和Snibe系统上进行CA242的测定。每天1个批次，每1批次对各浓度样本分别重复测量3次，连续进行5 d，然后计算均值、标准差(standard deviation，SD)和变异系数(coefficient of variation，CV)，评价批内不精密度(CVr)和总不精密度(CVI)与厂家声明的CV的差异。

1.3.2 正确度评价 参考NCCLSEP15-A2文件[12]和国内毕波等研究[13]的方案要求进行，复测不同批号校准品，重复测定3次计算平均值，将实测值均值与靶值进行比较，计算相对偏差，根据当前技术水平，以厂家声明允许偏差(10%)的1/2为可接受标准。

1.3.3 回收试验 参考既往报道[13]的方案要求进行，180 μL临床血清样本中加入20 μL生理盐水制备成基础样品，180 μL临床血清样本中加入20 μL 的100 U/mL的校准品制备成回收样品，分别用两个检测系统测定CA242，重复测定取均值，并计算回收浓度、加入浓度和回收率，回收率=回收浓度/加入浓度×100%。

1.3.4 临床样本血清CA242的检测 抽取空腹静脉血3.0～5.0 mL，置于37 ℃恒温孵育至血液凝集完全，3 800 r/min离心10 min后分离血清，-80 ℃冰箱保存，检测前进行复温。采用Bioscience检测系统和Snibe检测系统同时对临床样本血清中CA242浓度水平进行检测；检测前按照仪器的标准作业程序(standard operating procedure，SOP)操作规程进行每日维护，然后做室内质量控制，合格后再进行样本检测，并记录检测的实验数据。

1.3.5 两个检测系统结果的一致性分析 分析Snibe系统和Bioscience检测系统间的差值变化情况，绘制数值偏差图、百分比偏差图和百分比差值频数分布图，观察两种检测系统之间结果差异分布情况。根据两个检测系统差值图的潜在特征，选择最佳的回归模型对两个检系统的结果进行拟合分析，计算斜率、截距及95%CI，并采用Bland-Altman图分析平均绝对偏差与相对偏差。

1.4 统计学分析

采用SPSS18.0软件和MedCalc软件进行统计分析。计量资料分布采用K-S检验；配对资料比较采用配对样本t检验或Wilcoxon符号秩检验。偏移和回归分析选择最适回归模型分析；正态分布数据采用Pearson 相关分析，非正态分布数据采用Spearman相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 精密度评价结果

Snibe 检测系统测定批内不精密度(CVr=2.87%，3.41%)、总不精密度(CVI=4.64%，5.92%)均符合该检测系统的CA242试剂说明书CV<10%的标准；Bioscience 检测系统测定批内不精密度(CVr=3.82%，3.21%)、总不精密度(CVI=4.88%，5.70%)也均符合该检测系统的CA242试剂说明书CV<10%的标准。见表1。

表1 两个检测系统测定CA242精密度评价结果

2.2 正确度评价结果

正确度评价结果显示Snibe 检测系统和Bioscience检测系统测定CA242，不同水平校准品检测均值与标示值的偏差分别为-2.00%～2.61%和-2.00%～2.33%，均低于可接受允许误差标准(5%)，即以厂家声明允许偏差(10%)的1/2为可接受标准。见表2。

表2 两个检测系统测定CA242正确度评价结果

2.3 回收试验结果

Snibe 检测系统回收率为97.0%～104.0%，Bioscience检测系统回收率为96.0%～103.0%，各系统回收率为95.0%～105.0%，满足回收试验的性能要求。见表3。

表3 两个检测系统测定CA242回收试验结果

2.4 临床样本血清CA242结果的比较

两种检测系统分别对健康人群组(n=106)、结直肠癌人群组(n=61)血清CA242水平进行检测。健康组血清CA242水平呈正态分布，而结直肠癌组血清CA242水平呈偏态分布。健康组中两种检测系统检测CA242的结果比较，差异无统计学意义(P=0.056，P>0.05)，结直肠癌组中两种检测系统检测CA242的结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.5 两种检测系统测定血清CA242结果的一致性评价

2.5.1 两种检测系统测定CA242差值比较分析 数值偏差图以参照系统Snibe系统测定的CA242结果为 X 轴，以Bioscience系统和Snibe系统CA242结果的差值(U/mL)为 Y 轴。百分比偏差图以参照系统Snibe系统测定的CA242结果为 X 轴，以两种检测系统结果百分比差值(%)为 Y 轴。数值偏差图和百分比偏差图显示两种系统间CA242 差值在低浓度差值变化较大，在高浓度时差值变化较为恒定，差值具有混合变化的特征。百分比差值频数分布图以两种检测系统结果百分比差值(%)为 X 轴，百分比差值出现的频数(%)为 Y 轴，结果显示两种方法间的百分比差值呈非正态分布。见图2及图3。

2.5.2 两种检测系统测定CA242结果一致性分析 根据差值数据变化特征，选择采用 Passing-Bablok 模型进行拟合分析两个检测系统间CA242结果的相关性。以Snibe检测系统测定的血清CA242结果作为X轴，以Bioscience检测系统测定的血清CA242结果作为Y轴，绘制Passing-Bablok回归分析图。回归方程为：Y= 0.0 706+1.018X，斜率为1.018，95%CI：0.996～1.030，截距为0.0 706，95%CI：-0.151～0.299，Bioscience与Snibe检测系统测定的血清CA242结果存在良好的关系(r=0.981，95%CI：0.974～0.986，P<0.05)。以两个检测系统测定的CA242均值为X轴，两个检测系统差值结果作为Y轴，绘制Bland-Altman散点图，评价两个检测系统间CA242结果的一致性。两个检测系统的平均差值为0.6 U/mL(95%CI：0.156 ～1.308)，95%的一致性界限范围为-8.8～10.0 U/mL，其中4.19%(7/167)点在一致性界限外，其它95.81%的点均分布在平均差值水平线上下及一致性界限内。在一致性界限范围内，最大差值为9.23 IU/mL，相差幅度在临床上可接受范围内。两种检测系统测量CA242结果具有很好的相关性和一致性。见图4及图5。

3 讨论

肿瘤标志物是由肿瘤细胞或细胞膜表面产生，或由机体对肿瘤产生免疫反应而生成，分泌或脱落到人体体液或组织中的物质，其在肿瘤的早期筛查、辅助诊断、疗效检 测、预后判断及治疗指导过程中都有着举足轻重的地位。CA242是一种唾液酸化的糖链抗原，能被人结肠癌细胞株Colo205经杂交瘤技术获得的单克隆抗体识别[3-4]；常见于结直肠癌、胰腺癌诊断及疗效监测[6-7]。CA242在胰腺癌中的诊断价值与CA19-9相似[14-15]，但其表达不受Lewis抗原和胆汁分泌的影响，较CA19-9具有更高的特异性和敏感性。Nilsson等[16]认为，CA242和CEA联合检测对诊断结直肠癌的敏感性更高；并且CA242随着临床病期的进展而呈现浓度显著增高趋势，提示结直肠癌的分期、淋巴结转移、肿瘤侵犯深度及预后。此外，CA242对胃癌、肺部恶性肿瘤等其他恶性肿瘤都有一定的诊断及鉴别诊断价值[17-18]。

CLIA法是一种将特异性高的抗原抗体反应与灵敏度极高的化学发光技术相结合的测定方法，相比与其他方法，CLIA法具有准确性好、敏感度高、稳定性高、检测快速且易于自动化等优点。但是包括CLIA法在内的免疫检测技术平台由于长期被进口品牌霸占，并且CLIA检测技术由于技术壁垒相对较高，国产试剂发展相对较晚，目前大多数检测试剂被进口品牌占据[19]。但是随着国内检验技术行业的发展，CLIA检测领域肿瘤标志物等主流项目国产品牌的占比不断提升。为积极响应国家对国产仪器的研发、转化与应用，探讨不同国产检测系统之间CA242的检测结果的差异和一致性。本研究以川北医学院常用的深圳新产业(Snibe)的检测系统为参考检测系统，天津博奥赛斯(Bioscience)检测系统为比较检测系统，对化学发光免疫分析法测定血清CA242结果的一致性进行评估，为国产检测仪器及配套试剂的临床应用提供依据。本研究中选择深圳新产业(Snibe)检测系统为参考检测系统，主要是因为川北医学院以该系统检测CA242的室间质评结果参加了国家卫生健康委临床检验中心(NCCL)的能力验证，验证结果均为满意，且该系统目前为国内市场占有率较高的肿瘤标志物检测系统。

本研究在对Snibe 和Bioscience检测系统结果进行一致性评价前，根据自身条件对两个仪器检测系统分别进行了基本的方法学性能验证，主要包括检测系统精密度和正确度的性能评价指标。试验结果显示两个检测系统测定CA242的精密度和正确度性能指标均小于厂家声明的误差标准，回收率均<5%，两个检测系统均能满足实验室方法性能指标要求。然后分别采用Bioscience检测系统和Snibe检测系统对健康对照组和结直肠癌组患者血清CA242进行测定，在两组对象中两个检测系统的CA242测定结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)。为了评估比较Snibe系统和Bioscience检测系统间的差值变化情况和结果的一致性，通过绘制数值偏差图、百分比偏差图和百分比差值频数分布图，观察两种检测系统之间结果差异分布情况。两个检测系统差值具有混合变化的特征，同时两种方法间的百分比差值呈非正态分布，所以选择最佳的回归模型Passing-Bablok 模型进行拟合分析，并采用Bland-Altman图分析判断两个检测系统间结果的差异和一致性分析。Passing-Bablok 模型拟合分析显示两个检测系统测定的血清CA242结果存在显著的线性相关(r=0.981，P<0.05)。Bland-Altman图分析对两个检测系统CA242的结果进行一致性分析，95.81%的点均分布在平均差值水平线上下及一致性界限内，说明两个检测系统结果具有较高的一致性，两者在临床应用中可以相互替代，能够为临床提供可靠准确的检验结果。但本研究也存在一定的局限性，由于实验条件限制，未能同时与进口设备及试剂进行比较。此外，部分检测高浓度检测样本数较少，可能会导致分析结果有所偏差，存在的问题有待后面进一步研究解决。

目前肿瘤物标志物检测由于不同厂家、不同试剂盒存在，检验结果可能存在差异。实验室人员在使用相关检测系统之前，应做好检测系统性能验证和标本比对，以避免不同检测系统带来的检验结果不一致对临床诊断、治疗的影响。为了积极响应国家对国产医学检验仪器的研发、转化与应用，对国产仪器进行临床应用性能的验证和评价工作，对于促进及帮助国内生产企业提升产品性能，促进国产仪器品牌影响力、用户认可度和市场销量有重要作用。

综上，天津Bioscience检测系统和深圳Snibe检测系统测定CA242精密度、准确度均满足临床方法学检测性能要求，且两个检测系统检测CA242结果具有较高的相关性和一致性。