牛妊娠相关糖蛋白6快速检测试纸条的制备及应用

李志明，许海涛，高玉平，蔡德霖，王相国，肖龙菲，安 红，王颖秋，王 骞，郭 勇，齐晓龙，倪和民

（1北京农学院动物科学技术学院，北京 102206；2全国畜牧总站，北京 100125；3天津市蓟州区下仓镇人民政府，天津 301905）

0 引言

在现代规模化牧场管理中，提高奶牛单产量，尽早诊断出奶牛妊娠可以有效缩短配种期，保证奶牛具有持久泌乳高峰期及较短的空怀周期，从而增加产奶量，提高经济效益[1]。目前确定奶牛妊娠的方法主要有以下几种：直肠触诊法、B超检查法、孕酮检测法，但都有其不可避免的弊端。直肠触诊法操作简单，成本低，但会造成一定比例的胚胎损失（胚胎死亡、胎儿死亡以及误诊）[2]；B超检查在人工授精30天之后方可进行准确诊断妊娠，但由于仪器价格较高，体积较大等原因，难以广泛应用于生产实践中[3]；孕酮浓度虽然随发情周期而变化，但脂肪也会对其造成严重干扰，因而无法准确确定是否妊娠[4]。因此，建立一种新的方法在早期确定奶牛妊娠与否至关重要。

牛妊娠相关糖蛋白(Pregnancy-associated glycoproteins，PAGs)在胎儿胎盘的滋养层双核细胞与母体子宫上皮细胞融合时，会释放到母畜血液中[5]，与未孕奶牛在28天后的血液检测量相比有显著增高，并在临近分娩前达到最高水平。目前，boPAGs基因家族至少有22个转录本以及变异体，根据前人的研究将boPAGs分为2类：古代PAGs和现代PAGs[6]。Green等[7]用核糖核酸酶保护实验检测胎盘中boPAGs RNA的表达 ，发现 boPAG2、boPAG4、boPAG5、boPAG8、boPAG9、boPAG10、boPAG11在妊娠后25天就已经表达；boPAG1从授精后浓度递增，并且在授精后第240天达到峰值[8]，但由于其半衰期长（＞8天），其免疫反应性在产后80～100天仍可检测到，容易影响产后早期奶牛妊娠诊断的准确性[9-10]。Telugu等[11]在基因水平检测中发现boPAG2比其他boPAGs蛋白的转录水平都高，表明boPAG2在奶牛妊娠早期发挥重要作用。boPAG4的半衰期为4.3天，相比于boPAG1的半衰期较短，且在妊娠早期（24～28天）就能被检测到[12-14]。boPAG6在妊娠早期表达，在妊娠末期（约250天）消失，其半衰期相对较短，以boPAG6作为标志物应用于母牛早期妊娠诊断的准确性更高，且不易产生假阳性现象[7]。

研究表明通过免疫学方法检测boPAGs与B超结果符合率非常高，且能够在配种后30天即可获得是否怀孕的结果，已经被广泛应用[15-16]。目前常用的早期妊娠 检 测 蛋 白 主 要 有 PAG1、PAG4、PAG6、PAG9、PAG16、PAG18、PAG19等[14,17]，但是有关抗体的研究仅涉及到boPAG1、boPAG2和boPAG4，针对PAG6多克隆抗体研究的报道在国内尚未出现。本试验利用前期制备的牛妊娠相关糖蛋白PAG6多克隆抗体制备快速检测试纸条，为奶牛妊娠的早期诊断提供了方法，为兽医的临床诊断提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

索莱宝公司：PVDF膜、NC膜、牛血清白蛋白(BSA)、5% BSA封闭液；碧云天公司：DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒、PBS；康为世纪公司：HRP标记山羊抗小鼠lgG；泉州科诺迪生物科技有限公司：牛妊娠相关糖蛋白(PAGs)ELISA检测试剂盒；实验室制备的PAG6多克隆抗体。试验于2020年9月—2021年6月在北京农学院动科楼511实验室进行。

1.2 试验方法

1.2.1 快速检测试纸条的制备 分别用水、PBS、含1% BSA的PBS将PAG6多克隆抗体稀释至2～50 μg/mL。将不同稀释度的抗体分别点样至固定载体上，每滴10μL，分别在不同条件下进行固定。随后在37℃温箱中进行封闭，60 min后使用PBST清洗试纸条5 min。

1.2.2 检测方法的建立 先将待检血清样品进行倍比稀释，吸取10 μL滴加至点样孔，分别于不同条件下进行孵育，孵育后PBST清洗芯片3次，每次3 min。随后，使用山羊抗小鼠IgG H&L(HRP)的二抗在37℃温箱中对试纸条进行孵育1 h，孵育后PBST清洗3次，每次3 min。最后，分别选用DAB、TMB和ECL显色液进行显色，肉眼观察检测结果。

1.2.3 检测试纸条的布局 根据优化条件，对检测试纸条进行点样，每组3个重复，制备3×3检测试纸条矩阵。

1.2.4 判定标准的确定 肉眼下，检测试纸条监测点显色较深即可视为怀孕奶牛。

1.2.5 敏感性验证 将待检血清进行检测试纸条检测，同时使用商品化的PAG试剂盒进行检测，最后将所获得的检测结果相比较。

1.2.6 特异性验证 取1组制备好的检测试纸条，分别检测未孕奶牛血清、怀孕奶牛血清和二者的混合血清，检测在不同血清的显色效果。

1.2.7 重复性验证 在3个不同时间点，每次制备3组快速检测试纸条，对同一批临床血清进行检测。

1.2.8 稳定性验证 将同一批制备的检测试纸条分别于不同条件下保存数周后，取待检血清进行检测。

1.3 数据处理

使用Excel和SPSS 22.0软件进行数据处理。试验数据均以平均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 抗体固定载体的选择

抗体分别选用NC膜、PVDF膜2种载体进行固定，结果如图1所示，抗体均能够固定于上述2种载体上，且均可与血清中的蛋白进行良好反应，但考虑到肉眼观察效果，最终确定NC膜为最适蛋白固定载体。

图1 抗体固定载体的选择

2.2 点样缓冲液的选择

抗体分别选取无菌水、PBS和含1%BSA的PBS进行稀释，结果如图2所示，抗体在3种点样缓冲液稀释下均有明显显色反应，其中以PBS组效果最好。因此，本研究选择PBS作为点样缓冲液。

图2 点样缓冲液的选择

2.3 抗体点样浓度的选择

选取PBS作为抗体稀释液，使用3种浓度的稀释液进行试验。如图3所示，抗体在50 μg/mL和10 μg/mL条件下有明显显色反应。但考虑成本，最终确定10 μg/mL为最适抗体点样浓度。

图3 抗体点样浓度的选择

2.4 抗体固定条件的选择

本研究分别设计4种抗体固定条件：37℃30 min、37℃ 60 min、25℃ 2 h、4℃ 8 h。结果如图4所示，抗体在37℃60 min和37℃30 min条件下效果均较好。考虑到时间成本，最终选择37℃30 min作为最佳抗体固定条件。

图4 抗体固定条件的选择

2.5 封闭剂种类的选择

以PBS作为阴性对照，分别选取5%BSA和5%脱脂乳2种封闭剂进行试验。如图5所示，抗体在2种封闭剂条件下显色效果均较好，但考虑试剂成本后，确定5%脱脂乳为最佳封闭剂。

图5 封闭剂种类的选择

2.6 待检血清孵育条件的选择

将未孕奶牛和怀孕奶牛血清滴加至检测试纸条后分别在37℃温箱中孵育30 min、60 min、25℃温箱中孵育2 h、4℃冰箱中孵育8 h。如图6所示，考虑到显色效果和检测时间后，确定37℃孵育60 min效果最好。

图6 待检血清孵育条件的选择

2.7 检测试纸条最低检测限的确定

为明确其最低检测限，利用检测试纸条对经过梯度稀释的血清进行检测。如图7所示，试纸条分别与1600～12800倍稀释的血清孵育结合，试纸条在1600～3200倍稀释下显色效果均较好，所以用于判别诊断的最低检测限为3200倍。

图7 蛋白芯片最低检测限的确定

2.8 显色方法的选择

分别选取DAB、TMB以及ECL显色液进行检测试纸条的显色，结果如图8所示，TMB显色液组的结果反应过快，不宜观察，而ECL显色需要专业显影仪器设备。因此，本研究最终选择DAB显色液。

图8 显色方法的选择

2.9 显色时间的选择

选取DAB显色液在1、3、5 min和10 min作为显色时间点进行优化。结果如图9所示，试纸条在3、5 min和10 min显色条件下效果均明显，随着显色时间增加背景加深。因此，确定3 min为DAB显色液的最佳显色时间。

图9 显色时间的选择

2.10 检测试纸条特异性分析

如图10所示，在混合血清中仍然可以检测，证明试纸条特异性较强。

图10 蛋白芯片特异性分析

2.11 检测试纸条敏感性分析

取10头奶牛待检血清进行检测，并与ELISA测定结果进行对比。如图11所示，为ELISA测定结果的标曲，计算得出5头奶牛怀孕，5头奶牛未怀孕，通过与检测试纸条的对比，二者符合率为80%，证明试纸条敏感性好。

图11 Bovine PAGs标准曲线

2.12 检测试纸条重复性分析 本研究用不同时间制备的试纸条进行重复性验证，每份样品重复3次，结果与预期一致，证明重复性好。

2.13 检测试纸条稳定性分析 本研究将于同一批次制备的检测试纸条分别于4℃和-20℃保存14天和28天。结果如图12所示，2周内试纸条显色效果均明显，证明检测试纸条保存在4℃和-20℃条件下2周内性能稳定。

图12 蛋白芯片稳定性分析

3 讨论

对于奶牛养殖行业而言，高效配种能增加产奶量、降低护理成本，提高企业效益[1]。因此，尽早发现奶牛妊娠能够减少其配种次数，降低胚胎死亡率，并且提早发现空怀现象，能缩短产犊间隔时间，提高奶牛繁殖率[18]。研究表明与未怀孕的奶牛相比，怀孕奶牛第24天母体血液循环中PAG浓度有所增加[19]；在授精后的24～26天母体血液循环中PAG增加[20-21]。

目前国内市场有关PAGs早期诊断产品主要为ELISA试剂盒，常用的早期妊娠检测PAGs主要有PAG4、PAG6、PAG9、PAG16、PAG18、PAG19等[17]。笔者前期通过原核表达方式获得了PAG6蛋白，免疫小鼠后制备了多克隆抗体，检测发现其具有较高的抗体滴度，可以用来制备奶牛早期妊娠诊断检测试纸条。

目前，可视化芯片技术在动植物病毒检测、食品中抗生素残留检测、基因分型、酶功能鉴定等方面广泛应用[22-24]，且蛋白质芯片技术在兽医诊断学上的应用，近些年来也已取得了巨大进步[25-27]。本试验通过优化载体材质、点样浓度、显色方法等检测的各个环节，将抗体用PBS稀释成10 μg/mL点样至NC膜上，在37℃温箱中固定抗体30 min，经5%的脱脂奶粉封闭，清洗后制成标准化检测试纸条。待检血清滴加至试纸条后，在37℃温箱中孵育1 h后，进行洗涤和二抗孵育，最后在DAB显色试剂盒作用下显色3 min即可观察。初步临床检测表明，在稀释3200倍的最低检测限的情况下，在混合血清中仍然可以检测出怀孕，该检测试纸条特异性强；此外，该方法与ELISA的符合率在80%，敏感性良好。试验重复性良好，并能在4℃和-20℃条件下，保存2周。虽然本方法仅针对一种蛋白，在面临复杂的妊娠环境下存在局限，但作为直肠触诊和超声波诊断检测技术的替代方法，在协助临床诊断方面仍能起到积极的作用。快速检测试纸条兼具平价、易操作、易推广、易保存等优点，能够深入基层临床，打破美国企业对中国相关行业的垄断控制，提高中国奶牛早期妊娠诊断效率。

4 结论

制备了奶牛妊娠相关糖蛋白6快速检测试纸条，待检血清滴加至试纸条后，在37℃温箱中孵育1 h后，进行洗涤和二抗孵育，最后在DAB显色试剂盒作用下显色3 min即可判定，可用于奶牛早期妊娠诊断，该法具有简便、快速、特异性好等优点。