GeneXpert MTB/RIF Ultra在肺外结核诊断中的研究进展

董裕 张福真 尚媛媛 逄宇

肺外结核占所有结核病的15%～20%[1],它可以独立存在,也可以与肺结核同时存在。大多数情况下,肺外结核是由肺结核直接蔓延、淋巴循环或血液传播引起[2],主要累及肠道、脑膜、淋巴结、骨骼、关节、肾脏和皮肤等组织[3]。肺外结核的感染途径和感染部位多样,临床表现复杂,缺乏特异性诊断[4],容易与其他疾病的局部临床症状混淆,导致误诊率和漏诊率升高。由于诊断的困难和延迟,肺外结核的发病率和死亡率较高。为了满足早期诊断的需求,临床迫切需要能够快速准确诊断肺外结核的实验室方法,以便配合临床积极开展治疗。

当前肺外结核的实验室诊断依旧以病原学检测为主,通过检测到结核分枝杆菌菌体或其核酸。由于肺外结核的发病部位广泛,标本不易获取且标本质量难以控制,使得病原学方法诊断肺外结核的局限性较明显[5]。免疫学检测方法虽然操作简便快速,敏感度和特异度较高,但是检测结果易受机体免疫水平波动的影响,并且还无法区分结核分枝杆菌潜伏感染或新近感染[6]。因此,开发和评估新型检测方法在肺外结核诊断中的实际应用是至关重要的。2017年3月,世界卫生组织(WHO)推荐使用超敏结核分枝杆菌及利福平耐药基因检测(GeneXpert MTB/RIF Ultra,简称“Xpert Ultra”)取代GeneXpert MTB/RIF(简称“Xpert”)[7]。Xpert Ultra作为一种快速、高敏感度的分子生物学检测方法[8],将为肺外结核的早期快速诊断提供新的技术支撑。

Xpert Ultra的原理及现状

为了提高检测结核分枝杆菌的敏感度,Xpert Ultra采用了两种不同的多拷贝扩增靶标(IS6110和IS1081),并采用了比Xpert更大的DNA反应室(Xpert Ultra为50 μl PCR反应,而Xpert为25 μl)。同时,Xpert Ultra还采用了全嵌套核酸扩增技术、更快速的热循环技术,以及改进的流体技术和酶,因而使得检测限(limit of detection,LOD)由每毫升114个菌落形成单位(CFU)降低为16个CFU[9]。Xpert Ultra作为一种新型的诊断技术,相较于Xpert具有更高的敏感度和特异度,尤其是对于少菌标本的检测效能有很大的提升[10]。王淑琦等[11]采用Xpert Ultra和Xpert检测结核分枝杆菌标准株H37Rv,二者均可以在样本浓度大于200 CFU/ml 时100%判断利福平耐药。Xpert检测利福平敏感度的LOD为112.6 CFU/ml(95%CI:91.9～152.8 CFU/ml),而Xpert Ultra则为105.4 CFU/ml(95%CI:78.5～178.8 CFU/ml)。相较于Xpert的检测时间,Xpert Ultra阳性和阴性结果的报告时间也有所缩短,可以更快速地获得检测结果[11]。一项针对成人肺结核患者的前瞻性多中心研究显示,Xpert Ultra的诊断敏感度高于Xpert,在涂片阴性但培养阳性的痰标本中,敏感度分别为63%和46%(样本数135份);在合并HIV感染者的培养阳性痰标本中,敏感度分别为90%和77%(样本数115份)[12]。可见, Xpert Ultra具有良好的敏感度和特异度,是一种快速诊断早期结核病的新方法。但是,Xpert Ultra对肺外结核的诊断在一定程度上受标本类型等因素的影响,因此,需要重点关注并评估影响诊断效能的因素,提出解决或优化方案以提高实验室诊断的准确性,更有效地对肺外结核进行防控和治疗[13]。

Xpert Ultra在各类肺外结核诊断中的应用

一、Xpert Ultra在结核性脑膜炎诊断中的应用

结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)是结核感染最严重的一种形式,新发患者占结核病新发患者的1%～5%[14]。TBM的临床症状非常严重,引起的脑膜炎死亡率可达50%以上[15]。对于合并HIV感染患者来说,情况更加严重,其死亡风险将增加3倍[16]。如果早期诊断延误,患者将无法接受最佳治疗,可能导致残疾或死亡[17]。因此,准确的早期诊断和及时的有效治疗对于挽救TBM患者的生命至关重要。

目前,诊断TBM主要通过分析患者脑脊液的病原学检测结果、Xpert检测结果及临床症状进行综合诊断[18]。Xpert Ultra的出现给TBM的诊断提供了新途径。Cresswell等[19]的研究对204例疑似脑膜炎的乌干达成年人进行了脑脊液Xpert Ultra 检测,其中有96%的患者合并HIV感染。以临床诊断为参考标准,Xpert Ultra检测的敏感度为76.5%(95%CI:62.5%～87.2%),优于Xpert检测的敏感度[55.6%(95%CI:44.0%～70.4%)]和分枝杆菌培养的敏感度[61.4%(95%CI:45.5%～75.6%)]。但该研究是以临床医生的经验性判断作为参考标准得出的实验结果,缺少说服力,同时也缺乏对特异度这部分数据的关注。另一项由Bahr等[20]利用22例TBM患者冷冻保存的脑脊液标本进行检测的研究,结果显示,Xpert Ultra检测的敏感度为95%(95%CI:77%～99%),而Xpert和分枝杆菌培养检测的敏感度均为45%(95%CI:24%～68%)。在这项研究中,Xpert Ultra也表现出优于其他两种检测方法的敏感度。另外,该研究还表明低温保存脑脊液并不影响Xpert Ultra的检测结果,但由于标本数量较少,仍需要进一步扩大标本数来验证结果。由Shen等[21]进行的一项荟萃研究分析了Xpert Ultra和Xpert对601例患者脑脊液标本的检测结果,结果显示两者的特异度均高达100%,但是Xpert Ultra具有更高的敏感度。以上研究中,Xpert Ultra均表现出良好的诊断效能,但Cresswell 等[19]在HIV阳性人群中发现,虽然Xpert Ultra检测TBM的敏感度高于Xpert和分枝杆菌培养,但是Xpert Ultra的阴性似然比却为 93%,这不足以在结果为阴性时排除TBM。

由此可见,Xpert Ultra对TBM的诊断具有一定的参考价值,但HIV患者免疫功能的受损会影响Xpert Ultra的检测敏感度和特异度,这导致 Xpert Ultra在当前实际应用中需要筛选适用人群以满足临床需求,会给TBM的诊断带来繁琐与不便。因此,在后续研究中不仅需要优化Xpert Ultra以提高其检测脑脊液标本的敏感度,还应关注Xpert Ultra 在HIV患者等免疫受损人群中的应用,补充其适用对象,增加其适用面,提高其诊断准确性和可靠性。

二、Xpert Ultra在骨关节结核诊断中的应用

骨关节结核是一种罕见的肺外结核,其发病率约占肺外结核总发病率的3%～5%[22]。最常见的受累部位是脊柱,尤其是胸腰椎,其病理特点主要表现为骨骼破坏和结核性肉芽组织形成[23]。骨关节结核的诊断困难及治疗延迟,会导致严重的关节畸形和功能障碍[24]。

骨关节结核的早期临床表现不典型,实验室检测和影像学检查特异度较低,导致骨关节结核漏诊率较高[25]。Ngcelwane等[26]对55例脊柱结核患者的组织和脓液标本进行Xpert Ultra检测,47例为阳性,其中有23例患者的组织和脓液均呈阳性。由于研究者没有设置标准对照,这使得研究数据参考价值有限。Sun等[27]使用Xpert Ultra对132例骨关节结核患者的关节液标本进行检测。在这些骨关节结核患者中,19例涂片镜检阳性,52例培养阳性,104例通过Xpert检测为阳性,120例通过Xpert Ultra检测为阳性。该研究中Xpert Ultra检测的敏感度为90.91%,分别高于Xpert(78.79%)、培养(39.39%)和涂片(14.39%),其中Xpert Ultra在涂片阳性标本中的敏感度为100%,在培养阳性标本中的敏感度为96.15%,在同涂片法比较中,Xpert Ultra表现出良好的敏感度,但同作为金标准的培养法比较中,Xpert Ultra出现漏检的现象。Mekkaoui等[28]评估了Xpert Ultra对27份骨关节标本检测的表现,以培养结果作为参考标准得出Xpert Ultra的敏感度为100%,特异度为87.5%。可见,Xpert Ultra在骨关节结核的诊断中具有潜在的应用价值,但仍需更多标本来验证。

三、Xpert Ultra在淋巴结结核诊断中的应用

淋巴结结核是肺外结核的常见形式之一,其中颈部淋巴结肿大最为常见,腹股沟、腋窝、肠系膜、纵隔和乳腺内也有报道[29]。淋巴结结核的早期诊断非常困难,大多数淋巴标本的采集需要进行有创性操作[30]。Perez-Risco等[31]以培养为参考标准评估了Xpert Ultra对25份淋巴结标本的诊断性能,结果显示其敏感度为94.1%,特异度为100%。Antel等[32]对73例患者甲状腺穿刺活检组织进行Xpert Ultra检测,发现其敏感度为70%,特异度为100%。这项研究的结果支持在怀疑淋巴结结核的情况下,进行超声引导下甲状腺细针穿刺抽吸活检,并进行Xpert Ultra检测,以便在微创、高敏感的条件下快速获得诊断结果。同时,Mekkaoui等[28]的研究已经证明Xpert Ultra对HIV流行环境中淋巴结结核的诊断具有高度敏感性。这项研究报告了以培养为参考标准,Xpert Ultra对196例患者甲状腺穿刺活检组织的敏感度和特异度分别为95.8%和81.6%。尽管淋巴结结核的诊断通常需要有创性检查,但在配合Xpert Ultra这种高效准确的检测方法下表现出优异的诊断能力,因此,应尽快推动其在临床实践中的应用,从而提高淋巴结结核的早期诊断效率和治疗效果。

四、Xpert Ultra在泌尿生殖系统结核诊断中的应用

泌尿生殖系统结核是肺外结核的一种常见形式,约占肺外结核患者的5%～40%[33]。该疾病可以发生在各个年龄段,但主要发生在四五十岁的男性身上。泌尿生殖系统结核是一种严重的潜在疾病,通常在晚期才出现症状,出现诊断延误,并可能导致泌尿生殖器官的损伤[34]。目前,只有少数研究关注使用Xpert Ultra来评估尿液诊断泌尿生殖系统结核的效果。Perez-Risco等[31]以培养为参考标准,评估了Xpert Ultra对24份尿液标本的诊断性能,结果显示其敏感度为100%,特异度为100%。另一项研究分析了少量尿液样本,并将Xpert Ultra的结果与培养结果进行比较,发现其敏感度为100%[35]。这些研究结果均表明,Xpert Ultra在泌尿生殖系统结核的诊断中表现出良好的性能,可以作为一种高效、准确的诊断方法。然而,目前相关研究仍然较少,Xpert Ultra在泌尿生殖系统结核诊断中的应用价值仍需要深入探讨。

总结与展望

作为世界卫生组织推荐的用于肺外结核诊断的分子诊断技术,Xpert Ultra尽管在肺外结核的诊断中发挥重要作用,但是Xpert Ultra仍然存在一些局限性。首先,Xpert Ultra的敏感度提高在一定程度上会影响其诊断特异度[11];其次,作为一种基于PCR的检测技术,Xpert Ultra仍无法区分活菌和死菌[36],因此,在具有结核病病史的患者中的诊断局限性明显。同时,Xpert Ultra的诊断效能还受限于不同类型的肺外结核标本。在分析感染部位体液时,Xpert Ultra在脑脊液和骨关节积液中表现出较高的诊断价值,可以为临床前期诊断和抗结核治疗给予指导作用。此外,Xpert Ultra在淋巴结结核的淋巴组织活检中表现出良好的敏感度和特异度,可以为淋巴结结核的诊断提供新方式。尽管Xpert Ultra在尿液检测中的标本数量较少,但已经表现出良好的诊断效能。目前相关研究仍然相对较少,需要进一步挖掘Xpert Ultra在肺外结核诊断中的应用价值。

随着免疫缺陷和免疫受损人群比例的增加,肺外结核的感染风险也在上升。肺外结核的临床症状缺乏特异性,使得诊断具有挑战性。此外,Xpert Ultra的诊断效能受到感染部位、标本类型、标本质量和HIV感染等因素的影响,需要完善肺外结核的标本选择体系,建立规范的标本采集和检测流程,评估其对不同人群的适用性,优化其能适应复杂的诊断环境。另外,Xpert Ultra作为一种高成本检验方法,在资源匮乏的环境中难以广泛应用,尤其对于结核病高负担国家而言。因此,Xpert Ultra在肺外结核中尽管表现出优异的诊断价值,仍需要进一步改良和优化,使其兼顾普遍适用性和经济实用性,以便更广泛地应用于肺外结核的诊断和治疗。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献董裕:起草文章;张福真和尚媛媛:对文章的知识性内容作批评性审阅;逄宇:对文章的知识性内容作批评性审阅、获取研究经费、行政/技术/材料支持、指导、支持性贡献