佛坪保护区冬季大熊猫犬瘟热病毒的预防与监测措施

刘新玉，刘 锟，何念军，柳梓晨，党超琪

(1.陕西佛坪国家级自然保护区管理局，陕西 汉中 723400；2.陕西省宁西林业局，西安 710300；3.中国农业大学 动物医学院，北京 100193；4.陕西省气象服务中心，西安 710014)

犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus,CDV)主要传染源为患病动物及其分泌物、排泄物和血液或被其污染的饲料、用具和饮用水等；直接或间接接触传染源均可被传染，高发于冬季[1]。近年来，在陕西佛坪国家级自然保护区周围开展的研究发现，患病大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)体内分离出的CDV毒株全基因组与家犬(Canislupusfamiliaris)及貉(Nyctereutesprocyonoides)分离毒株具有高度同源性，因此，家犬携带的CDV极有可能在犬和大熊猫中产生种间传播[1]。在对陕西佛坪国家级自然保护区和四川唐家河国家级自然保护区家犬携带CDV情况进行的风险评估中，发现两地家犬抗体阳性率分别为71.0%和96.4%，说明该保护区内家犬生活的环境中存在CDV的流行史；同时通过GPS定位和地理信息技术进行研究得知，大熊猫与家犬活动范围有所重叠，推断野生大熊猫的生存环境已受到家犬源CDV的威胁[2]。

近几年来，国家在保护区建设上投入了大量精力，保护区生态环境有了明显改善，珍稀野生动物种群的数量得到显著提高。但种群的增加也使人类与各种野生动物生存空间的重叠率大大提升，加深了野生动物与家养动物共患疾病的风险。其中，以犬瘟热为主的病毒性传染病对野生动物的危害最大，有研究表明，CDV在自然环境内局部性爆发，很可能导致某些诸如东北虎(Pantheratigrisaltaica)等小种群野生动物的灭绝[3]，这已成为严重制约保护区野生动物生存的一大因素。

据全国第四次大熊猫调查数据显示，截至2013年底，全国野生大熊猫种群数量比第三次调查增加了268只，达1 864只，增长了16.8%，其中分布于陕西省秦岭山区的秦岭亚种共计345只[4]。尽管大熊猫的数量得到了显著增长，但大熊猫疫病时有发生。1982年，南京动物园2只圈养大熊猫和2只小熊猫死亡，张振兴等[5]从疫病症状、病理变化、流行情况、免疫预防等方面推断死因系大熊猫的CDV与李斯特菌感染所致，并称之为熊猫瘟热病；胡学贵等[6]报道了某圈养大熊猫机构2只大熊猫感染CDV并死亡的病例。此后，各地动物园及圈养大熊猫机构均有大熊猫感染犬瘟热的病例报告[7]。1999年，李金中等[8]首次用PCR方法进行基因序列分析，确诊了死亡的大熊猫系犬瘟热病毒感染。Mainka等[9]在卧龙保护区圈养的大熊猫血清中检测到CDV抗体。2014年12月，陕西省爆发大熊猫犬瘟热疫情，导致5只圈养大熊猫染病并全部死亡，死亡率达100%。当前我国家养犬数量庞大，但免疫率低，犬瘟呈现大流行趋势明显，这很可能是CDV通过家犬传播至野生动物重要的一个途径[3]。

佛坪县森林覆盖率达90.3%，常住人口约3.5万人，由于历史、地理等因素，佛坪保护区内村民习惯散养家犬来看家护院，但是由于食物匮乏，家犬经常成群结队进入山区自由觅食，而且会自由来往于保护站，加之佛坪保护区内的大熊猫在冬季时喜欢从高海拔山地迁徙至低海拔的村庄周围，增加了家犬将CDV传播至野生大熊猫种群的风险。因此，本研究将对保护区内自由活动的家犬进行CDV免疫注射，并引入未免疫犬只(哨兵犬)作为环境病毒监测的指示动物，同时在佛坪保护区内利用GIS技术成熟的可视化功能，及其对野生动物种群栖息地强大的空间分析能力[10]，分析免疫后家犬、哨兵犬和野生大熊猫的空间分布格局，探究此措施在冬季野生大熊猫CDV的预防与监测中的可行性。

1 研究方法

1.1 调查地点及试验动物

调查地点为佛坪保护区不同海拔高度的3个保护站，分别为A组(凉风垭保护站，33.6975°N，107.9344°E)、B组(三官庙保护站，33.6453°N，107.7941°E)、C组(大古坪保护站，33.5894°N，107.7743°E)，其中凉风垭和三官庙分别距离大古坪约16 km与8 km。

试验动物为3个保护站的健康家犬，共34只，同时引入大古坪保护站9只未进行过CDV疫苗免疫且犬瘟热抗体检测阴性的犬为D组(作为哨兵犬组)。登记每只犬的年龄、性别等信息，并拍照记录。所有犬只自由活动且可以穿梭于各保护站，年龄在10月龄至6岁不等，各类犬种均有涉及，所有犬只和5只野生大熊猫均佩戴GPS项圈，记录其活动轨迹。

1.2 CDV疫苗注射

对3个保护站(A、B、C组)的34只家犬注射卫佳伍商品化CDV弱毒活疫苗，疫苗注射当日A组分布5只，B组分布6只，C组分布23只，9只哨兵犬(D组)不注射疫苗。

1.3 血清的采集与CDV抗体检测

设置注射疫苗当日为D0天，注射疫苗后第一天为D1天，依此类推。所有犬只均在D0与D21天分别采5 mL静脉血，室温放置2 h后，3 000 r·min-1离心5 min，取血清备用。使用CDV抗体(IgG)检测试剂盒(西班牙英吉纳公司)对所有血清CDV抗体进行检测。

1.4 D21天家犬和哨兵犬的活动区域与冬季大熊猫活动区域的关系分析

每日沿预设的6条路线收集5只野生大熊猫GPS项圈数据，每隔100 m搜索3次GPS项圈信号，将5只野生大熊猫活动轨迹点通过ArcGIS 10.2软件的核密度分析模块的固定核空间法计算,得出野生大熊猫的冬季活动区域面积，并对D21天34只家犬与9只哨兵犬的活动点位进行空间聚集分析。

1.5 家犬与哨兵犬CDV抗原监测

于D30、D45、D60天，分别采集34只家犬与9只哨兵犬的鼻液、唾液和泪液样本，利用CDV胶体金试纸法检测犬只体内CDV抗原携带情况。

1.6 数据统计分析

将各保护站犬只D0及D21天血清检测样本的双孔OD平均值代入标准曲线的直线回归方程式，计算对应样本的抗体IgG浓度(N)，所得负值代表样本中抗体浓度为零，并计算D0及D21天的抗体IgG浓度差(ΔN)。使用SPSS 25.0软件对各保护站家犬血清检测样本的CDV抗体浓度进行单样本K-S检验，若符合正态分布，则使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)比较3个保护站(A、B、C组)与哨兵犬组中犬只样本的CDV抗体浓度的组间差异。

2 研究结果

2.1 CDV抗体水平

表1 标准品及空白对照孔平均OD值

表2 试验组(34只家犬)间接ELISA检测样本抗体浓度

以标准品浓度以及OD值(表1)计算出的标准曲线的直线回归方程式为y=220.59x-27.478，标准品线性回归与预期浓度相关系数为：R2=0.9949，根据该ELISA试剂盒以R≥0.9900为准确性评价标准，表明该试验具有准确性。

将34只家犬以及哨兵犬血清样品的OD值代入方程得出CDV抗体浓度，根据3个保护站家犬D0天CDV初始抗体水平检测结果的中位数，以100 μg·mL-1为界限，将所有犬只的CDV初始抗体水平分为高水平和低水平。结果表明(表2)：试验组中67.65%的家犬CDV初始抗体水平属于低水平，其中C组中初始抗体水平呈现低水平的犬只占该保护站家犬的69.57%，高于其他2组。3个保护站部分犬只体内初始抗体水平较高，由于所有犬只在本研究前均无接种疫苗史，推测可能由于曾经暴露于CDV造成感染所导致。D21天3个试验组所有家犬均达到高抗体水平。D组D0天的初始抗体水平与D21天抗体水平均为低水平(表3)。

比较3个试验组家犬注射疫苗后血清抗体浓度差值发现，不同海拔高度的保护站的犬只注射疫苗后，抗体水平的提升没有显著地域差异(P>0.05)。比较试验组犬只注射疫苗后与哨兵犬组的血清抗体浓度差值，试验组犬只注射疫苗后，其中低初始抗体水平犬只的血清抗体浓度全部提升为高抗体水平，而哨兵犬组抗体水平无提升，存在显著性差异(P<0.05)，故注射疫苗后3个保护站犬只抗体水平的提升显著高于未注射疫苗的哨兵犬(图1)。

表3 对照组(9只哨兵犬)间接ELISA检测样本抗体浓度

2.2 注射CDV疫苗后D21天家犬与哨兵犬的分布与野生大熊猫冬季活动区域的关系

固定核空间法计算得出冬季5只野生大熊猫活动区域面积为65.18 km2，此面积覆盖了通向凉风垭、三官庙与大古坪3个保护站的主干线路；通过核密度分析可以看出，注射疫苗D21天后家犬在大古坪保护站分布密度最高，应作为后续疫情监控与犬只免疫的重点区域(图2)。D0天引入大古坪保护站的哨兵犬在D21天后有6只分布在大古坪保护站，3只移动到三官庙保护站，且均分布在野生大熊猫冬季活动区域内。

2.3 家犬与哨兵犬CDV抗原监测结果

D30与D45天保护区内3个保护站所有犬只CDV胶体金试纸检测结果均为阴性。D60天7只哨兵犬出现CDV胶体金试纸阳性结果，其中凉风垭保护站与三官庙保护站各2只，大古坪保护站3只(表4)。D60天3个保护站分布的34只家犬的CDV胶体金试纸检测结果依然为阴性。此外，不同时间点各保护站内的家犬与哨兵犬的分布数量并不固定，再一次说明保护区内犬只可自由穿梭于3个保护站之间，为CDV的大范围传播增加了风险。

表4 家犬与哨兵犬CDV抗原监测结果

3 讨 论

本试验选用CDV弱毒活疫苗在佛坪保护区内单次接种后，3个保护站34只家犬血清内CDV抗体水平均有较显著的提升，且均可达到保护效价，产生较好的免疫效果。根据乔贵林等[11]的研究，接种CDV弱毒疫苗后D21天时，只有约80%的试验犬只抗体效价超过1∶100，到D35天时，才有100%的试验犬只抗体效价超过1∶100，与本试验结果有所差异，推测可能是由于使用的疫苗株不同导致的结果。相徳忠[12]对犬只紧急免疫前后体内抗体的变化情况进行了观察，发现犬只在紧急免疫一次CDV弱毒疫苗后体内的抗体呈现低—高—低的变化规律。由于本研究中试验犬为自由活动的犬只，受抓捕等操作限制，只进行了单次免疫并只检测了D21天的抗体水平，在后续研究中将会持续观察D21天后的抗体水平变化规律，为再次加强免疫CDV疫苗的时间点提供基础数据。同时，Jin等[13]研究认为佛坪保护区内的野生大熊猫会在夏天迁徙至高海拔地区采食箭竹，而在冬季会再次迁徙至低海拔区采食，与本研究中冬季野生大熊猫活动区域一致，位于低海拔的村庄周围，覆盖在凉风垭、三官庙和大古坪保护站沿线地带。冬季为犬瘟热病毒的高发季节，这无疑为3个保护站的家犬向野生大熊猫传播CDV创造了机会。

本试验D0天检测的34只家犬中有部分犬只体内初始血清抗体的含量较高，由于所有犬只在本研究前均无接种疫苗史，所以推测该现象是由于家犬曾经暴露于CDV环境所导致，表明保护区可能存在CDV的流行史，但之前并没有引起足够的关注。然而于D60天成功监测到7只哨兵犬体内CDV抗原，并且这7只哨兵犬的分布范围已遍布大古坪、三官庙和凉风垭三个保护站，其作为无抗体保护的哨兵动物，起到了对保护区潜在CDV的监测作用，并警示保护区工作人员应及时加强环境消杀力度以及将患病犬只进行栓养治疗，削弱保护区内CDV对野生大熊猫的威胁。本试验设置的不携带CDV抗体的哨兵犬，因具有自由穿梭于各保护站的特点，可以作为野生大熊猫冬季活动区域内CDV的环境监测指示“工具”，通过定期对其体内CDV抗原的监测，可作为该区域是否爆发CDV的风险评估数据源。

4 结 论

在冬季对保护区内家犬进行CDV疫苗接种，可以显著提高家犬对CDV的抵抗力，而保护区内引入的无CDV抗体的哨兵犬会受到环境病毒影响并感染CDV。这表明免疫后的家犬在大熊猫冬季活动区域内形成CDV免疫屏障的同时，哨兵犬也对大熊猫冬季活动区域内的CDV起到监测作用，故在保护区内对家犬进行CDV疫苗接种并设置哨兵犬的举措，可以成为冬季佛坪保护区内大熊猫CDV的有效预防与监测措施。