云南不同地区大绒鼠种群的表型性状差异与分子遗传差异的比较与分析

任月， 贾婷， 张浩， 王政昆， 朱万龙

（1.云南省高校西南山地生态系统动植物生态适应进化及保护重点实验室，云南师范大学生命科学学院，生物能源持续开发利用教育部工程研究中心，云南省生物质能与环境生物技术重点实验室，昆明650500；2.云南经济管理学院，昆明650106）

群体间数量性状（quantitative trait across populations，QST）与分子遗传差异（differentiation in neutral marker，FST）的比较，即QST-FST比较，为研究人员区分自然选择和遗传漂变作为复杂多基因性状群体分化的原因提供一种手段（Brommer，2011）。其中，FST是传统衡量种群遗传分化和种群遗传的基本指标（Wright，1943），在遗传学领域被广泛应用；QST是指在遗传漂变、选择、基因流和环境适应性等因素作用下，群体间数量性状的差异（Brommer，2011）。当QST＞FST，则研究性状编码的基因差异超过了漂移基础上的预期，这表明自然选择在不同种群中偏爱不同的表型；当QST=FST，则不能排除观察到的分化仅仅是由遗传漂变引起的；当QST＜FST，则相同的表型在不同的群体中受到偏爱，并发生稳定的选择（Merilä & Crnokrak，2001）。大多数植物和动物，包括人类，可细分为许多孤立的种群，根据自然选择、遗传漂变、迁移和突变的相对强度，种群在遗传和表型上会出现分化（Wright，1931；Holsinger & Weir，2009）。了解影响这种分化的原因和结果对生物科学具有重要意义，包括基础研究：进化生物学、生态学和遗传学，以及应用领域：林业和渔业管理、医学生物学（Leinonenet al.，2013），尤其是可以确定种群分化是由自然选择过程还是中性遗传（即遗传漂变）过程造成的。因此，测量与中性分化有关的QST是一项适用于进化生物学和保护生物学的重要研究。然而，许多物种，特别是濒危物种，无法完成计算其狭义或广义QST所需的育种实验。目前大量研究均以群体间表型性状差异（differentiation in phenotypic traits，PST）来 代 替QST（Leinonenet al.，2006；周 陆 等 ，2012）。PST的量化是基于对野生环境中多个种群中若干个体的性状的表型测量（Brommer，2011）。

大绒鼠Eothenomys miletus为横断山区的特有种（朱万龙等，2009；彭培英等，2015），无性二型特征（朱万龙等，2009）。自第三纪以来，由于青藏高原的隆起、横断山脉的形成，气候条件总体上由湿热向干旱寒冷的方向演化（Liet al.，2014）；形成了西北高、东南低的基本地势，海拔变化剧烈，形成了年温差小、日温差大、立体气候显著等特点，导致植被条件和动物的栖息环境多样，边缘效应明显；横断山不同地区的地貌、气候等生态因子差异明显，很可能引起生活于此的生物出现遗传和表型的变异。云南不同地区大绒鼠体质量、能量代谢（任月等，2020a，2020b）和头骨几何形态（张海姬等，2019）已经出现明显分化。本研究选择云南德钦、香格里拉、丽江、剑川和哀牢山的大绒鼠为研究对象，基于群体亚种间的SNP标记计算的FST和基于调查到的性状数据计算PST，通过比较二者的关系，可进一步了解不同进化机制对云南山区大绒鼠群体间差异的程度和作用大小，并为其他小型野生哺乳动物的类似研究提供参考或借鉴。

1 材料与方法

1.1 研究对象

73只健康非繁殖期成年大绒鼠于2018年9月—2019年1月采自云南5个不同海拔地区：德钦（DQ：99°3′E，28°35′N，3 459 m；n=11）、香格里拉（XGLL：100°23′E，28°30′N，3 321 m；n=14）、丽江（LJ：100°22′E，27°27′N，2 478 m；n=15）、剑川（JC：100°15′E，26°43′N，2 590 m；n=20）和哀牢山（ALS：100°42′E，25°30′N，2 217 m；n=13）（图 1）。野外捕获后带到当地防疫站，灭蚤处理后称量体质量（精确到0.01 g），断颈处死，取肝脏置于干冰中，带回云南师范大学动物实验室，-80 ℃保存。

图1 云南省5个地区大绒鼠的采样点Fig. 1 Locations of 5 sampling sites of Eothenomys miletus in Yunnan Province

1.2 形态学测量

大绒鼠的身体指标测量参照高文荣（2017）的方法，包括自然状态的体质量、体长和尾长等（分别精确到0.01 g和0.01 cm）。头骨指标测量参照杨奇森等（2005）和夏霖等（2006）的方法，包括颅全长和颅基长等（精确到0.01 cm）。

1.3 分子遗传差异指数测量

采用苯酚/氯仿法从动物肝脏组织样本中提取总DNA。采用Covaris（基因有限公司，香港）将1～3 μg的DNA剪切成200～500 bp的片段。使用Rsal酶法（北京百迈克生物技术有限公司，北京）获得9.19×特异性位点扩增片段（specific-locus amplified fragment，SLAF）标记（Sunet al.，2013），其插入尺寸为 464～494，SLAF进行 3’端加A处理、连接Dual-index（Kozichet al.，2013）测序接头、PCR 扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后，采用Illumina HiSeqTM2500测序。去除含有接头和低质量的reads（质量值Q的碱基数占整条reads的50%以上）。使用Burrows-Wheeler Aligner 0.7.12-r1039算法将原始reads与橙腹田鼠Microtus ochrogaster参考基因组（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/10848）进行序列比对（Li & Durbin，2009），并使用 GATK 3.3（McKennaet al.，2010）和samtools（Version 1.2）（Liet al.，2009）开发 SNP，对原始SNP进行过滤，过滤条件为完整度≥0.05，数据已上传NCBI数据库（未发布）。

1.4 统计方法

采用SPSS 20.0对校正后的性状数据进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），（Wójciket al.，2006；Raeymaekerset al.，2007），式中为种群间方差为种群内的方差，h2为遗传力（由于加性遗传效应而产生的表型方差的比例），c为总体方差的比例，该比例被认为是群体间的加性遗传效应，假设样本之间的环境方差是随机分布或不存在的。基于高质量的SNP位点，使用 R 3.6.3 中的 SNPRelate（Zhenget al.，2012）计算两两种群间的FST，成对性状PST和FST进行独立样本t检验。2个采样点间地理距离、海拔差、冬季平均温度差和冬季总降水量差与大绒鼠PST的相关性用双变量相关分析中的Pearson分析方法；利用一般线性模型对两点间地理距离、海拔差、冬季平均温度差和冬季总降水量差与PST进行线性回归分析。其中，2个采样点间的地理距离为两点直线距离。平均环境温度和总降水量数据从国家气象科学数据中心（http：//data.cma.cn/）下载。

2 结果

2.1 云南不同地区大绒鼠表型性状差异性分析

单因素方差分析结果显示，除下齿列长（P=0.389）外，横断山5个地区大绒鼠的体质量、体长和尾长等各项表型性状均具有显著差异性（P＜0.05；表1）。

表1 云南5个地区大绒鼠表型性状差异性分析Table 1 Phenotypic difference of Eothenomys miletus from 5 different areas in Yunnan Province

2.2 PST与FST比较

PST与FST的绝对值比较显示（图2），除DQ和XGLL种群的上齿列长，DQ和LJ种群的后肢长，DQ和JC种群的下齿列长，XGLL和LJ种群的后肢，LJ和JC种群的耳宽，LJ和ALS种群的体长和最大眶间距，JC和ALS种群的最大眶间距和下齿列长外，其余性状的PST值均大于两两种群间的FST值。独立样本t检验显示，所有测试性状的PST均极显著大于FST（P＜0.01）。

图2 云南5个地区间大绒鼠的PST和FST比较Fig. 2 Comparison of PST and FST for Eothenomys miletus from 5 different areas in Yunnan Province

2.3 两两种群间PST与地理距离、海拔差、冬季平均温度差和冬季总降水量差的相关关系分析和线性回归分析

两两种群间PST与地理距离、海拔差、冬季平均温度差和冬季总降水量差的相关性分析和线性回归分析结果表明，地理距离与种群间各性状的PST无相关关系（P＞0.05），海拔差与种群间的体质量、体长、尾长、前肢长、最大眶间距和上齿列长等性状的PST呈正相关关系（P＜0.05），冬季平均温度差与体质量、体长、尾长、前肢长和最大眶间距的PST呈正相关关系（P＜0.05），冬季总降水量差与躯干长、耳长的PST呈正相关关系（P＜0.05），与其他性状的PST无相关关系（表2）。

表2 云南5个地区间大绒鼠两两种群间PST与地理距离和环境差异的相关性分析和线性回归分析Table 2 Relationship of pairwise PST with geographic distance and environmental difference of Eothenomys miletus from 5 different areas in Yunnan Province

3 讨论

本研究对云南不同海拔地区的大绒鼠形态学指标测量和分析，结果表明，云南不同海拔地区大绒鼠表型性状具有显著差异。通过对QST和FST的比较，可推断自然选择对复杂表型性状的作用，以及量化群体中数量性状的空间遗传结构的程度（Merilä & Crnokrak，2001；McKay & Latta，2002；Leinonenet al.，2006），对解决与进化和生态遗传学相关问题具有实用性意义（Leinonenet al.，2010）。由于实验室条件无法对许多野生动物进行育种实验，无法获得计算QST所需要的种群定量遗传数据，在鸟类（Merilä，1997；Saetheret al.，2007；Phillimoreet al.，2008）、鱼类（Storz，2002）、哺乳类（Wójciket al.，2006）、两栖类（Alhoet al.，2010）和甲壳类（周陆等，2012）等研究中一般采用PST替代QST。本研究通过将云南5个不同地区大绒鼠14个性状的成对PST与FST进行比较，发现种群间的成对性状PST均大于FST，提示其表型性状受到较明显的选择压力，环境因子可能是影响大绒鼠表型分化的关键。对黄喉姬鼠Apodemus flavicollis头骨性状的研究表明，颅骨形状、下颌骨大小和下颌骨形状的PST均大于FST，表明性状受到强自然选择，而颅骨大小也受到较弱的自然选择（Wójciket al.，2006），与本研究中大绒鼠颅全长和颅基长等头骨性状受选择压力的结果相符。

环境因子是影响小型哺乳动物表型分化的关键因素（任月等，2020a，2020b），对中国12个地区中缅树鼩Tupaia belangeri表型性状的PST和FST比较分析，发现地理距离较远的种群间各表型性状均表现为PST＜FST，而地理距离较近的则为PST＞FST，提示地理距离较远的种群处于稳定的中性选择之中，其进化过程主要受遗传漂变影响，而地理距离较近的种群受到明显的选择压力，进化过程主要受自然选择的影响（高文荣，2017）。本研究中大绒鼠各表型性状的PST与地理距离无相关关系，而海拔差、冬季平均温度差和冬季总降水量差与部分性状PST呈正相关关系，提示地理距离可能不是影响云南不同地区大绒鼠表型分化的因素，而海拔、环境温度和降水量等环境因子可能是影响其表型分化的因素。

综上所述，云南不同地区大绒鼠已出现表型分化，种群间性状的PST＞FST，表明云南不同地区大绒鼠各表型性状受到明显选择压力，即其进化过程主要受自然选择影响，而海拔、环境温度和降水量可能是影响其种群间表型分化的环境因子。这些结果对研究不同进化机制对云南的大绒鼠群体间差异影响提供一定理论依据，而对地理距离较远的大绒鼠种群间的PST和FST尚待进一步研究。