狗头赤芍质量标准的提升研究

蔡远东 薛朝金 李天佑 何 羽

贵州省毕节市市场监督管理局检验检测中心，贵州 毕节 551700

狗头赤芍为毛茛科植物美丽芍药PaeoniamaireiLévl.、草芍药PaeoniaobovataMaxim.的干燥根。春、秋二季采挖，除去根茎、须根及杂质，干燥。其功能为活血化瘀，凉血调经。用于瘀滞胸胁疼痛、腹痛、目赤、痛经、经闭、衄血、跌扑损伤[1]。美丽芍药主要分布于贵州毕节、威宁等地，草芍药主要分布在贵州麻江、锦屏、威宁、赫章、水城、遵义等地[2-3]。根据相关报道[4]，狗头赤芍主要化学成分为芍药苷、 羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷(白芍苷)、 芍药新苷、 芍药苷元酮等。芍药苷具有保肝、保护神经细胞、保护缺血性的脑损伤及神经损伤的作用，还具有抗抑郁作用、抑制炎症作用[5]。没食子酸具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等活性[6]。狗头赤芍收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003年版)，标准只对其粉末进行了显微鉴别，不能全面反映药材整体质量。本文采用HPLC法同时测定狗头赤芍中没食子酸和芍药苷的含量，为质量标准的提升提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters e2695 高效液相色谱仪，2998二极管阵列检测器。电子天平：MSE3.6P-OCE-DM，由赛多利斯科学仪器(北京)有限公司生产；电子天平：AY120、BX420H由梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司生产。洁康超声波清洗机(超声功率：360 W，超声频率：40 KHz)由东莞市洁康超声波设备有限公司生产。

1.2 试药 没食子酸对照品(批号：110831-201602，含量以90.8%计)、芍药苷对照品(批号：110736-202044，含量以96.8%计)均由中国食品药品检定研究院提供。乙腈为色谱纯(美国TEDIA天地试剂公司)，实验用水为娃哈哈纯净水，稀乙醇：取乙醇(95%，天津市富宇精细化工有限公司)529 mL，加娃哈哈纯净水稀释至 1000 mL,即得稀乙醇。

1.3 样品信息 采集的样品经贵州省中药研究所陈德媛老师鉴定，为毛茛科植物草芍药PaeoniaobovataMaxim。样品详见表1。

表1 样品信息表

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：COSMOSIL- Packed- Column 5C18-MS-II 4.6ID×250 mm；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱；流速为1 mL/min；检测波长为230 nm；柱温为30 ℃；进样量：10 μL。梯度洗脱程序见表2，色谱图如图1，各成分分离度皆大于1.5。

表2 梯度洗脱表

1.没食子酸；2.芍药苷；A.试剂空白；B.对照品溶液；C.供试品溶液

2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取对照品没食子酸、芍药苷适量，加稀乙醇制成每1 mL含没食子酸、芍药苷分别为0.042 mg、0.052 mg的混合对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取本品适量，粉碎，研细，取约0.5 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，称定重量，超声处理(功率：360 W，频率：40 KHz)30 min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得[7]。

2.4 线性关系考察 精密量取“2.2”项下的混合对照品溶液1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL，分别置10 mL容量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度。分别精密吸取10 μL，按“2.1”项下的色谱条件测定，每个样品进样2次。以对照品浓度(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标进行线性回归。得到没食子酸和芍药苷线性回归方程、相关系数，结果见表3。

表3 没食子酸和芍药苷线性范围及回归方程 (n=5)

2.5 精密度试验 取“2.2”项下的混合对照品溶液，按“2.1”项下的色谱条件重复测定5次，分别计算2种成分的峰面积积分值。结果没食子酸、芍药苷峰面积的RSD值分别为0.5%、0.6%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取毕节市赫章县铁匠乡采集的狗头赤芍药材，粉碎，研细，取粉末5份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，每份平行测定2次，按“2.1”项下的色谱条件测定并计算各成分的含量。结果显示狗头赤芍中没食子酸、芍药苷的平均值分别为0.31%，2.28%；RSD值分别为1.33%、1.84%。表明方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取毕节市赫章县铁匠乡采集的狗头赤芍药材，粉碎，研细，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h进样，按“2.1”项下的色谱条件测定并计算各组分峰面积的RSD值，结果没食子酸、芍药苷峰面积的RSD值分别为0.50%、1.60%。说明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.8 加样回收试验 取毕节市赫章县铁匠乡采集的狗头赤芍药材，粉碎，研细，称取粉末6份，每份约0.25 g，加入没食子酸、芍药苷浓度分别为0.7258 mg/mL、5.4015 mg/mL的混合对照品溶液1 mL，按“2.3”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下测定并计算回收率。回收率平均值分别为99.58%、99.84%，RSD分别为1.17%、0.45%。结果见表4。

表4 狗头赤芍中两种成分的回收率试验结果

2.9 样品含量的测定 取不同产地的狗头赤芍样品适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，每份平行测定2次，按“2.1”项下的色谱条件测定并计算各成分的含量。测定结果见表5。

表5 不同产地狗头赤芍中没食子酸和芍药苷的含量 (%)

结果按干燥品计算，样品中没食子酸的含量为0.30%～0.47%，平均值为0.4%；芍药苷的含量为2.28%～3.24%，平均值为2.7%。从含量测定的结果看出，芍药苷的含量均高于《中国药典》(2020版)“赤芍”的含量限度1.8%，本品可以作为赤芍的替代品使用。没食子酸含量较高的样品，芍药苷含量也相对较高，如产于毕节市赫章县和威宁县的样品，含量的高低是否与地域和植物的生长周期有关，还待进一步的研究。

3 讨论

本研究分别采用甲醇-0.05 moL/L磷酸二氢钾溶液和乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，结果用甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液时，芍药苷色谱峰拖尾较严重，选用乙腈-0.1%磷酸溶液时，目标峰峰形较好，且与相邻杂质峰达到完全分离，取得了满意的效果。

采用稀乙醇为溶剂，分别考察了超声处理15 min、30 min和45 min，结果超声处理15 min时，样品含量较低，超声处理30 min和45 min时样品含量相差不大，说明超声处理15 min时，目标成分未提取完全，超声处理30 min和45 min时目标物提取较完全，为保证充分提取完全和缩短实验室操作时间，本次研究选择超声处理30 min。分别取稀乙醇、甲醇和50%甲醇作为溶剂，超声处理30 min，结果发现稀乙醇提取时目标物含量较高，故本研究采用稀乙醇为提取溶剂。

本实验采用HPLC法分别同时测定了5个不同产地的狗头赤芍中的没食子酸和芍药苷的含量，取得了较为满意的结果。该方法较为简便，重复性较好，可用于狗头赤芍的含量测定及质量评价，为狗头赤芍质量标准的提升提供方法依据。