青贮玉米蠕形菌的分离鉴定及其致病性分析

祁鹤兴，王海春，芦光新*，李宗仁，田 丰，贺晨邦，徐成体，邹海涛，雷生妍，李红芳，唐海鹏

(1.青海大学农牧学院，青海 西宁 810016；2.青海省草原总站，青海 西宁 810001；3.青海大学农林科学院，青海 西宁 810016；4.青海大学畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016)

青贮玉米(ZeaMaysL.)作为一种营养均衡，适口性好的优质饲料在全球畜牧业发达国家广泛种植[1-3]。近十几年来，随着玉米全膜双垄栽培技术在青海省的示范推广，青贮玉米栽培区域已扩大至高海拔和干旱地区。青贮玉米依其产量、品质和价值的优势发展速度快，潜力大，是青海省农业特色优势产业[4]。但是多种叶斑病的发生，影响青贮玉米产业的健康发展[5]。

玉米田间病害种类多，病因复杂，仅引起玉米病害的真菌就多达147余种，可造成叶部、茎部、穗部和根部等病害[6]。蠕形菌通常指形状似蠕虫，具有多个横隔膜的一类真菌，包括平脐蠕孢属(Bipolaris)、凸脐蠕孢属(Exserohilum)、内脐蠕孢属(Drechslera)和弯孢属(Curvularia)等多属真菌，大多数的蠕形菌都可侵染植物造成病害[7]。多种蠕形菌可侵染玉米，造成叶斑病害，如大斑凸脐蠕孢(E.turcicum)[8-9]、玉蜀黍平脐蠕孢(B.maydis)[10-11]、新月弯孢(C.lunate)[12-13]和麦根腐平脐蠕孢(B.sorokiniana)[14-15]等。

近十几年来，我国抗大、小斑病玉米品种的选育推广工作进展顺利，但是这也导致一些原来生产上的次要病害逐年严重，新病害逐年出现，造成新的产量损失。如链格孢叶斑病日趋严重，在云南省[16]、黑龙江省[17]、甘肃省[18]和青海省[5]等地都有报道，对玉米品质和产量造成危害。青贮玉米由于受到蠕形菌的侵染，不仅损害青贮玉米的品质和产量，病原菌所产生的各种毒素[8,10,12,14]还可能对青海省畜牧业造成影响，如影响肉羊肉牛品质，影响奶牛产奶质量等。玉米在青贮过程中，病原真菌可能对有益乳酸菌、酵母和其他霉菌产生影响[19-24]。研究者们从欧洲牛场采集158份青贮玉米饲料，对其中所含毒素进行检测，发现70%的样本都有毒素检出，87%的样本含有5种以上的毒素[25]。因此明确引起青贮玉米叶斑病的蠕形菌种类及其致病性对于后续开展病害防治，青贮饲料的解毒等至关重要。

本课题组于2018—2021年在青海省东部农业区民和县、大通县、乐都区和贵德县青贮玉米种植区进行病害调查时采集不同类型叶斑病样本，进行蠕形菌病原菌的分离、形态学和分子生物学鉴定，并进行致病性分析。旨在为后续病害分布、综合防治及病原菌毒素研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料来源

于2018—2021年在青海省西宁市、海东市和海南藏族自治州7个青贮玉米种植地(表1)采用五点取样法采集疑似病原菌病叶，共采集样本61份。8个青贮玉米主栽品种(‘铁研53’‘晋单60’‘金黄828’‘益农2020’‘中单2’‘豫玉22’‘金穗3’和‘甘玉23’)种子由青海大学畜牧兽医科学院提供。

表1 蠕形菌病原菌采集地点

1.2 培养基配制

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)和2%水琼脂培养基(2%WA)配制参照方中达[26]的方法。

1.3 病原菌的分离、纯化与保存

病原菌的分离纯化方法结合单孢分离法和组织分离法进行[5,27]。分离到的单孢菌株采用滤纸片保存法[28]，置于-20℃冰箱长期保存。

1.4 病原菌的分类鉴定

1.4.1菌株形态学鉴定 菌落形态观察：将分离纯化得到的单孢菌株接种于PDA平板，于25℃培养箱中培养7 d。用直径0.5 cm的打孔器取菌饼放置在PDA平板中。每株菌株3个重复，每皿培养基的厚度保持一致。放置于25℃培养箱培养7 d后，观察菌落形态。

分生孢子形态观察：使用接种针挑取分生孢子制成临时玻片，在40×光学显微镜下观察分生孢子形态。菌株形态学鉴定参照戴芳澜[29]。

1.4.2菌株基因组DNA的提取 采用CATB法提取基因组DNA[5,27]，最后用25 μL TE/RNase溶解沉淀，-20℃保存备用。

1.4.3菌株系统发育分析 rDNA-ITS扩增引物为ITS1和ITS4[27]，GADPH基因扩增引物为gpd-1和gpd-2[29-31]。

25 μL PCR反应体系：12.5 μL 2×PCR Mix(北京擎科新业生物技术公司)；各1.0 μL上下游引物(25 pmol·L-1)；模板DNA(30 μg·L-1)1.0 μL；双蒸水补足至25 μL。PCR反应程序：95℃，5 min；95℃，1 min，55℃，1 min，72℃，2 min，30个循环；72℃，10 min。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测产物，PCR扩增产物纯化后由北京擎科新业生物技术公司进行双向测序。

参照祁鹤兴等[5]和马桂花等[26]的方法构建系统发育树。142株菌株GENBANK登录号为OP412828-OP412970，OP476513-OP476654。

1.5 病原菌致病性测定

病原菌分生孢子制备参照祁鹤兴等[5]的方法。在直径为12 cm塑料花盆中加入营养土种植青贮玉米。采用离体划伤接种法和喷雾接种法测定病原菌致病性。

离体划伤接种法：剪取4～6叶期青贮玉米心叶中下部，用于接种8种青贮玉米，‘铁研53’‘晋单60’‘金黄828’‘益农2020’‘中单2’‘豫玉22’‘金穗3’和‘甘玉23’。每株菌重复接种3片叶片。每片叶片均匀划伤2处，在划伤处接种10 μL孢子悬浮液，以接种无菌水为对照。25℃黑暗保湿培养24 h，之后25℃光照培养6 d，观察青贮玉米叶片的发病情况。

喷雾接种法：使用生长期为2周的青贮玉米品种‘铁研53’用于菌株孢子悬浮液喷雾接种。每盆接种10 mL浓度为(1×105)个·mL-1的孢子悬浮液。接种后的植株放置在25℃黑暗环境下保湿培养1 d，之后25℃持续光照条件下培养6 d。每株菌株重复接种3盆植株，接种试验重复3次。叶片产生病斑后，在病健交界处剪取小块叶片置于水琼脂表面培养36 h，之后在显微镜下观察是否有病原菌分生孢子产生，以此来判断病斑是否是由对应病原菌侵染所造成。

2 结果与分析

2.1 青贮玉米蠕形菌病原菌的组成及形态学特征

对从青海省东部农业区7个采样地采集到的青贮玉米病叶进行病原菌的分离和纯化，共分离得到142株病原菌。2018和2019年，从民和县采集的病叶上各分离得到6株；2020年从乐都区分离得到3株；2020和2021年从大通县分别分离得到51株和26株；2021年从贵德县分离得到50株。通过菌株形态学特征和分子生物学鉴定发现，142株菌株分别属于3属，平脐蠕孢属真菌125株，凸脐蠕孢属真菌9株，弯孢属真菌8株。其中麦根腐平脐蠕孢和玉米生平脐蠕孢(B.zeicola)分离个数最多，分别为77株和48株，分离频率分别为54.2%和33.8%；其次，分离得到9株大斑病菌，分离频率为6.3%，新月弯孢、疣状弯孢(C.verruculosa)和穗状弯孢(C.spicifera)的分离个数分别为3株、2株和3株，分离频率分别为2.1%，1.4%和2.1%(表2)。

表2 蠕形菌病原菌分离个数及分离频率

青贮玉米蠕形菌病原菌的形态特征差别明显(图1)。麦根腐平脐蠕孢：菌落偶有缺裂，大多数为圆形，气生菌丝灰绿色至黑褐色，呈绒毡状。分生孢子暗褐色，椭圆形或长椭圆形，中间宽，两端渐狭钝圆，大多直或略弯，3～12个隔膜，脐点不明显，大小49.1～91.3×15.1～24.8 μm(平均：61.6×19.6 μm)。

图1 病原菌菌落形态和分生孢子形态

玉米生平脐蠕孢：气生菌丝发达，浅绿色至黑绿色。具有中央宽、两端渐窄、形状为长椭圆形的分生孢子；分生孢子少数略有弯曲，4～10个隔膜，大小为53.9～92.8 μm×11.22～23.35 μm(平均：78.0×14.2 μm)。

大斑病菌：菌落浅绿色至褐色，气生菌丝绒毡状，较繁茂。分生孢子梭形，浅褐色至深褐色，有的略向一方弯曲，顶细胞长椭圆形，基细胞尖锥形，脐点明显，2～10个隔膜，大小为60.8～124.3 μm×14.1～23.5 μm(平均：88.1×17.6 μm)。

新月弯孢：气生菌丝放射状扩展，呈墨绿色，丝绒状。分生孢子新月状，暗褐色，具3个隔膜，两端细胞稍小，颜色较浅，中间2个细胞膨大，第3个细胞膨大最明显。大小为17.4～24.8 μm×7.4～12.9 μm(平均：19.8×9.4 μm)。

疣状弯孢：菌落墨绿色，边缘偏白，丝绒状，老熟后呈黑色。分生孢子浅褐色，多弯曲，具3个隔膜，中间2个细胞比两端细胞更大、颜色更深，大小为19.6～26.5 μm×7.4～10.6 μm(平均：22.5×11.3 μm)。

穗状弯孢：菌落浅绿褐色，绒垫状，老熟后呈黑色。分生孢子椭圆形或长圆形，顶细胞和基细胞圆形，浅棕褐色，多具3个横隔，大小19.8～28.2 μm×8.1～11.6 μm(平均：23.9×9.7 μm)。

2.2 麦根腐平脐蠕孢叶斑病和圆斑病田间症状

麦根腐平脐蠕孢引起麦根腐平脐蠕孢叶斑病，该病典型病斑呈灰白色至黄色，圆形或椭圆形，坏死斑先从微小开始发展，扩展到大的坏死斑，并带有黄色褪绿的晕圈(图2)，该叶斑病在大通县普遍发生，发病率为10%～30%，严重度为3—5级。玉米生平脐蠕孢引起玉米圆斑病，典型病斑呈狭长状，中间浅灰色至褐色，周缘暗色，具有黄色晕圈(图2)。玉米圆斑病典型症状只在贵德县观察到，发病率为15%，严重度为3—5级。民和县和大通县虽分别分离得到5株和1株玉米生平脐蠕孢，但是在田间没有观察到典型症状。

图2 青贮玉米麦根腐平脐蠕孢叶斑病和圆斑病田间症状

2.3 病原菌系统发育分析

分别以43株病原菌代表菌株和14株参考菌株的rDNA-ITS序列和GADPH基因序列构建系统发育树(图3和图4)。分析发现构建的2个系统发育树具有相似的拓补结构，57株菌株被分为6个发育分枝。菌株CJZ-5，DTR-84，LD-206，MH1846-B，ST-1，LD-36和MH1859-B等20株菌株与麦根腐平脐蠕孢(B.sorokiniana)在同一发育分支上，亲缘关系最近。菌株GDX-8，MH-4-1，GDX-21，GDX-63和MH1848-A等10株菌株与玉米生平脐蠕孢(B.zeicola)在同一发育分支上，亲缘关系最近。菌株GDX-65，GDX-24和CJZ-8等5株菌株与大斑病菌(E.turcicum)在同一发育分支上，亲缘关系最近。菌株DT-114和DT-114-1与疣状弯孢(C.verruculosa)聚为一个分支，亲缘关系最近。菌株MH-41，MH1832-A和MH-4-1-1与穗状弯孢(C.spicifera)聚为一个发育分支，亲缘关系最近。菌株CJZ-11，LD-204-1和DT-68与新月弯孢(C.lunata)聚为一个分支，亲缘关系最近。

图3 基于43株代表病原菌rDNA-ITS序列构建的系统发育树

图4 基于43株代表病原菌GADPH基因序列构建的系统发育树

2.4 病原菌致病性分析

为分析6种病原菌对8个青海省青贮玉米主栽品种的致病性，首先采用划伤接种法进行接种。结果表明77株麦根腐平脐蠕孢和48株玉米生平脐蠕孢对8个品种都有致病性(图5)。大斑病菌、穗状弯孢、新月弯孢和疣状弯孢对8个品种的致病性存在差异(图5，表3)。大斑病菌中，菌株CJZ-8对‘豫玉22’和‘金穗5’不致病，对‘铁研53’‘晋单60’‘金黄828’‘益农2020’‘中单2’和‘甘玉23’致病，其余8株菌株能侵染的品种在2-5个之间，菌株GDX-66和GDX-81只能侵染‘金黄828’和‘益农2020’。穗状弯孢MH1832-A能侵染8个青贮玉米品种，其余2株菌株MH-41和MH-4-1-1能侵染4个品种。新月弯孢LD-204-1能侵染8个青贮玉米品种，其余2株菌株DT-68和CJZ-11能侵染6个品种。2株疣状弯孢具有相同的致病性，都能侵染‘铁研53’‘金黄828’‘金穗5’和‘甘玉23’，不能侵染其余4个品种。

图5 青贮玉米来源6种病原菌划伤接种8个青贮玉米品种

表3 青贮玉米4种病原菌接种结果统计

6种病原菌代表菌株喷雾接种‘铁研53’，发现下部老叶易感病，接种7 d后多数老叶腐烂发霉。且穗状弯孢、新月弯孢和疣状弯孢接种后叶尖也易出现腐烂发霉现象。玉米生平脐蠕孢和大斑病菌形成长条型典型病斑，病斑极易呈片状；麦根腐平脐蠕孢形成的病斑较小，但病斑也易连成片状。穗状弯孢形成小梭形病斑，新月弯孢形成圆形或椭圆形小病斑，疣状弯孢形成椭圆形或不规则小病斑(图6)。接种发病叶片经保湿培养 36 h后，用10×光学显微镜能观察到分生孢子梗和分生孢子，从发病病斑分离得到的菌株与野生型菌株菌落形态一致(图7)。

图6 青贮玉米6种病原菌喷雾接种铁研53

图7 青贮玉米6种病原菌致病性验证

3 讨论

青海省作为我国五大牧区之一，畜牧业是最具特色的传统产业之一。然而，青海省由于天然草场环境恶化导致牧草缺乏，家畜面临着“夏肥冬瘦”的问题[32]；冬季为藏系绵羊产羔期，但是冬季牧草缺乏导致羔羊死亡现象时有发生[33]。因此，饲料及其品质已成为影响青海省畜牧业持续发展的重要因素之一。青海省近十几年来大力发展青贮玉米产业，对于缓解天然草场退化和畜牧业可持续发展都起到了积极作用。

平脐蠕孢属、弯孢属和凸脐蠕孢属多种真菌能侵染玉米，造成产量和品质损失。本研究发现麦根腐平脐蠕孢、玉米生平脐蠕孢、大斑病菌、新月弯孢、穗状弯孢和疣状弯孢可以侵染青贮玉米，造成叶斑病。麦根腐平脐蠕孢[14-15]、玉米生平脐蠕孢[34-35]、大斑病菌[8-9]、新月弯孢[12-13]引起的叶斑病在国内外都严重影响玉米产量和品质。2016年郭玉杰等报道穗状弯孢可以引起玉米叶斑病，病斑呈梭形[36]。我们在民和采集的样本上分离得到3株穗状弯孢，在田间没有观察到典型症状，可能与其他病原菌复合侵染有关。但是喷雾接种的病斑呈现短条状的梭形，与郭玉杰等[36]的报道一致。疣状弯孢引起的玉米叶斑病在国内外尚未见报道。

麦根腐平脐蠕孢叶斑病在大通县3个采样地都有观察到，2019—2020年在湟中县和湟源县没有观察到该病害，但是2021年在这2个县进行病害调查时发现该病害已有发生。因此推测麦根腐平脐蠕孢叶斑病在青海地区有扩大的趋势，这可能与近几年的气温异常有关。玉米生平脐蠕孢在贵德县、民和县和大通县采样地分离得到，但是该病原菌引起的圆斑病典型症状只在2021年贵德县观察得到。玉米生平脐蠕孢存在生理小种分化现象，可以分为1—3号小种。我们根据该病害田间症状及室内喷雾接种症状特点分析，分离得到的玉米生平脐蠕孢为1号小种，该小种寄主专化性强，多产生卵圆形病斑，发病严重时病斑易连成一片[34,37-39]。玉米圆斑病是一种世界性流行病害，美国、瑞士、尼日利亚、德国和日本等国家均有发生，在我国陕西、云南、吉林、浙江、河北、辽宁、黑龙江、北京和内蒙古等省市自治区也属于常发病害[37]。

6种病原菌，共计142株菌株划伤接种8个青贮玉米品种后发现，77株麦根腐平脐蠕孢和48株玉米生平脐蠕孢都可侵染8个玉米品种，由此推测这8个青贮玉米品种对麦根腐平脐蠕孢和玉米生平脐蠕孢没有抗性。大斑病菌、穗状弯孢、新月弯孢和疣状弯孢分离得到的个数较少，但是在青海省其他青贮玉米种植区侵染情况如何尚未可知。后续我们将对这6种病原菌引起病害的综合防治方法及在青海全省内的分布情况进行研究。

4 结论

从青海省东部农业区青贮玉米叶斑病叶分离得到麦根腐平脐蠕孢、玉米生平脐蠕孢、大斑病菌、新月弯孢、疣状弯孢和穗状弯孢6种病原菌。麦根腐平脐蠕孢和玉米生平脐蠕孢分离个数最多，且8个青贮玉米品种对这2种病原菌没有抗性。本文首次报道疣状弯孢可以侵染玉米，造成叶斑病。