针刺内关和足三里双穴位对大鼠心肌缺血再灌注损伤后的血管重塑作用

张宏如，陈静，徐森磊，顾任钧，白桦，卢圣锋，潘玉璟，顾一煌

(1.南京中医药大学中医学院·中西医结合学院,江苏 南京 210023；2.南京中医药大学医学院·整合医学院，江苏 南京 210023；3.南京中医药大学针灸推拿学院·养生康复学院，江苏 南京 210023；4.南京中医药大学养老服务与管理学院，江苏 南京 210023)

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)是世界范围内死亡率较高的一种心血管疾病[1]。梗死心肌组织中大量心肌细胞坏死,最终被纤维细胞代替从而导致心肌功能丧失[2]。有心肌梗死病史的患者进一步发生冠状动脉疾病和脑部疾病的风险最高[3],同时,心梗幸存者更容易再度发生梗死[4]。目前,治疗最有效的方法仍是冠状动脉介入治疗(Percutaneous coronary intervention, PCI),使缺血心肌很快重新恢复血液灌流及氧供应,该过程称为缺血再灌注(Ischemia-reperfusion, I/R)。然而,再灌注是一把“双刃剑”,它在恢复心肌供血及供氧的同时也使其超微结构、代谢及功能的损伤更加严重,引起心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia-reperfusion injury, MIRI)[5]。血管新生即通过刺激心肌缺血区小血管生长,实现心肌缺血区的自我搭桥,从而建立缺血心肌的侧支循环,改善心肌缺血区的血流状况。血管新生能够改善心肌缺血状态,促进心肌梗死后恢复[6-8]。因此,促进血管新生对防治MIRI、治疗心肌梗死至关重要。

MIRI病位在心,我国传统医学中属“胸痹”“真心痛”的范畴,为本虚标实之症。现代临床试验和循证医学研究表明,针灸对再灌注损伤具有良好的治疗效果[9]。回顾以往针灸治疗心脏疾病的案例,取穴多以内关穴疏通心脉、镇痛安神[10]。梁繁荣和赵凌教授在2019 年发表于JAMAInternalMedicine的研究报告指出,以内关穴为主的针刺疗法治疗慢性稳定性心绞痛时,可显著减少患者心绞痛发作次数,降低心绞痛发作程度[11]。此外,足三里为阳明经之合穴、胃之下合穴,能够调补脾胃,益气养血,可治胸痹气血不足之本,也是临床治疗胸痹的重要腧穴之一。近年来,选用内关、足三里标本配穴治疗胸痹的报道日趋增多,强调治标与治本同时进行,效果显著[12-13]。同时,关于电针内关、足三里对心肌损伤等的修复作用也被发现[14]。然而,电针内关、足三里对于MIRI后血管重塑的作用及相关机制仍然有待研究。

血管新生是在缺血、缺氧的条件下,从预先存在的血管中形成新的毛细血管,它是机体的适应性反应,受多种环境因素的调控。新生血管可以重新供养,改善MIRI后心肌重塑。由于血管新生在心肌梗死后早期抢救缺血性心肌的潜在作用,促血管新生治疗成为治疗心肌梗死患者的新策略[15-17]。本研究拟通过构建MIRI动物模型,着重比较和探讨针灸内关、足三里双穴位对大鼠MIRI后的血管重塑作用,以期为针刺在临床心血管疾病治疗中的应用提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及造模

采用SPF级雄性SD大鼠50只,8周龄,体质量(280±20) g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号:SCXK(京)2021-0011。所有大鼠均饲养于南京中医药大学实验动物中心,饲养温度为(25±2)℃,湿度为 (50±5)%,给予普通光照(12 h 光照/12 h 黑暗),自由获取食物和水。实验过程中所有对动物的处置都严格遵守中华人民共和国科学技术部2006 年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》，并经南京中医药大学动物伦理委员会审批通过(批准号：202209A046)。

将大鼠分为空白对照组(10只)、MIRI组(10只)、内关组(10只)、足三里组(10只)以及内关+足三里组(10只)。构建MIRI动物模型[18],采用5%异氟烷伴70%氮气+30%氧气将大鼠快速诱导吸入麻醉,并维持在1%～2%的浓度,使大鼠仰卧位于(37±3) ℃的实验板上,使用呼吸机进行气管插管和机械通气(呼吸频率为45～60次·min-1,潮气量为10 mL·g-1。接心电监护仪,标准Ⅱ导联监测心电图。剔除胸前毛发,用75%乙醇消毒,于胸骨下端与左腋窝连线相交于4、5肋间处破皮,逐层分离肌肉和筋膜,暴露肋间,以止血钳钝性穿破3、4肋间,左手迅速挤出心脏,右手持针,在左心耳右缘下2～3 mm处结扎冠状动脉,宽度、深度约2 mm,缺血30 min后打开丝线结,使再灌注240 min。关胸逐层缝合,断开呼吸机,清除呼吸道分泌物。术后予常规青霉素以预防感染。模型构建过程中MIRI对照组3只,内关组和足三里组各有1只大鼠死亡,内关+足三里组2只大鼠死亡。

1.2 主要试剂和仪器

CD31抗体(1/100,#AF3628,美国R&D system公司),α-SMA抗体(1/100,# MAB1420,美国R&D system公司),VEGFA抗体(1/1000,ab155944,美国Abcam公司),p-eNOS(1/1000,ab215717,美国Abcam公司),GAPDH抗体(1/1000,ab8245,美国Abcam公司),Goat Anti-Mouse IgG H&L二抗(1/2000,ab96879,美国Abcam公司),DAPI染色液(DA0004,北京雷根生物技术有限公司)。

韩氏电针仪(HANS-200,南京济生科技有限公司);线性阵列换能器超声仪(H-300,美国Visualsonics公司);图像分析仪 Image pro plus 7.0 软件(美国国立卫生研究院);荧光显微镜(DMI8,德国徕卡公司)。

1.3 内关、足三里穴位选择与电针治疗

参照《实验针灸学》穴位定位方法选取大鼠内关穴和足三里穴。采用0.18 mm×13 mm一次性不锈钢毫针制成双极电针(用医用绝缘胶带将2根一次性针灸针针柄并列缠绕,保持两针身相隔 1 mm,露出针柄末端和针身),在双侧内关穴(PC6)和足三里穴(ST36)直刺 2～3 mm,接韩氏电针仪,疏密波,频率 2 Hz/100 Hz,电流强度 2 mA,针刺 20 min。于再灌注后第2天行电针治疗,每日1次,共14 d。MIRI对照组不予电针治疗。

1.4 心肌功能检测

于MIRI造模或电针治疗14 d后对大鼠进行吸入麻醉后仰卧固定,左胸前区褪毛。采用配备10 MHz的线性阵列换能器的超声仪,通过二维及 M 型模式进行测定。在 2D 模式下,在胸骨旁短轴切面深度 2 cm 处可见心脏成像,通过 100 mm·s-1的扫描速度测量左心室射血分数(LVEF)及左心室内径缩短率(LVFS)。

1.5 TTC染色法检测心肌梗死面积

实验结束后,取各组大鼠心脏于-20 ℃冰箱冻存 1 h,由心尖至心底部横向均匀切片(厚度为1 mm),于1%TTC 中 37 ℃ 孵育 15 min,10%福尔马林固定 10 min,数码照相机拍照,苍白色为梗死区。用图像分析仪 Image pro plus 7.0 软件处理得心梗面积百分比。

1.6 血管生成情况检测

取心肌组织,采用免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测心肌组织中 CD31、α-SMA共表达。将各组大鼠左心室组织固定脱水后横切成20 μm厚的连续切片。将组织放置在玻片上进行染色。一半切片在室温下用1% PBS中的5% BSA阻断1 h,采用一抗(CD31, α-SMA, 1∶100)在4 ℃孵育过夜。随后,采用二抗(1∶500)在室温下孵育1 h。采用DAPI染核。最后,采用×400荧光显微镜观察CD31和α-SMA荧光。

采用Western blot技术检测心肌组织中VEGFA、CD31、α-SMA、p-eNOS表达情况,充分评价心肌损伤后血管生成及成熟情况。具体实验步骤参考以往研究[19]。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠的超声心动图检查结果比较

采用超声心动图分析造模前后大鼠的心电情况。结果显示造模后的小鼠ST段抬高,提示发生心肌梗死(图1)。对电针处理前后心肌梗死大鼠的LVEF和LVFS参数进行比较，表明相对空白组,MIRI模型组的大鼠LVEF和LVFS参数显著降低(P<0.000 1)。针刺内关或足三里穴位的大鼠LVEF和LVFS参数较未进行针刺的MIRI大鼠显著升高(P<0.000 1),而针刺内关和足三里双穴位的大鼠LVEF和LVFS参数相比MIRI模型组(P<0.000 1)及针刺单穴位组(P<0.01)均有显著升高(图2)。

2.2 各组大鼠心肌梗死面积变化

TTC染色结果显示MIRI组的梗死面积显著高于空白组(P<0.000 1),提示造模成功。单独针刺内关穴(P<0.001)和足三里穴(P<0.01)能显著缩小梗死面积,而针刺内关穴和足三里双穴位相比针刺单个穴位能更有效的缩小梗死面积(P<0.05vs内关组,P<0.001vs足三里组)。见图3。

注:**P<0.01,****P<0.000 1。图2 超声心动图检测各组大鼠的LVEF及Fig.2 Detect the LVEF and LVFS by ECG

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1。图3 TTC染色检测各组大鼠心肌梗死面积Fig.3 Detect the infarct area in each groups using TTC staining

2.3 各组大鼠心肌组织中α-SMA、CD31等蛋白表达变化

免疫荧光法检测结果显示,与空白组比较,MIRI组大鼠心肌组织中α-SMA和CD31表达阳性显著减弱。相较MIRI组,单独针刺内关或足三里穴位组的大鼠心肌组织中α-SMA和CD31表达阳性增强,而针刺内关和足三里双穴位组的表达阳性强于MIRI对照组以及针刺单穴位组。见图4。

Western blot结果表明,MIRI组的α-SMA、CD31、VEGFA和p-eNOS蛋白表达水平相对空白组显著降低(P<0.000 1)。单独针刺内关或足三里穴位组的大鼠心肌组织中α-SMA(P<0.001,P<0.000 1vsMIRI组)、CD31(P<0.000 1vsMIRI组)、VEGFA(P<0.001,P<0.000 1vsMIRI组)和p-eNOS(P<0.001,P<0.001vsMIRI组)蛋白表达水平显著高于MIRI组,而针刺内关和足三里双穴位组的α-SMA、CD31、VEGFA和p-eNOS蛋白表达水平相对针刺单穴位组(P<0.000 1)和MIRI组(P<0.000 1)均显著升高。见图5。

图4 免疫荧光法检测各组大鼠心肌组织中CD31和α-SMA共表达情况Fig.4 Test the co-expression of α-SMA and CD31 protein in each groups by IF

注:***P<0.001,****P<0.000 1。图5 Western blot法检测各组大鼠心肌组织中VEGFA、CD31、α-SMA和p-eNOS蛋白表达变化Fig.5 Measure the protein levels of VEGFA, α-SMA and CD31 in each groups by Western blot

3 讨论

针灸疗法治疗心血管疾病历史悠久,针灸对心肌损伤后修复作用显著。本次研究基于前期研究中针刺内关对MIRI的良好疗效,结合祖国医学“治病必求于本”的理念增加足三里穴。温和针灸内关和足三里可以发挥心脏保护效应以减轻再灌注损伤[20]。现代医学采用电针处理能够有效治疗MIRI,促进损伤后心肌功能恢复。动物研究表明,内关穴针刺处理能显著改善慢性心衰小鼠的心衰程度[21]。临床研究表明,针刺内关穴对改善运动中的心肌缺血有显著作用[22]，针刺内关穴能影响大鼠心肌梗死区心肌重构[23]，针刺足三里穴也被报道能够有效保护大鼠心脏功能[24]，电针刺足三里穴位有助于恢复脓毒症大鼠心脏损伤[25]。足三里为足阳明胃经之合穴和胃下合穴,能够调理脾胃,补益气血以荣养心脉。内关为手厥阴心包经之络穴,通阴维脉,素有“心胸内关谋”之说,具有宽胸理气,活血通络的功效。治疗MIRI时,足三里为本穴,以补为主;内关为标穴,以攻为主,两穴合用共奏标本兼治之功。由此可见,针刺治疗MIRI等心脏疾病已取得了一定成效,并处于不断发展和深入探索之中。本研究通过单刺内关或足三里穴位、针刺内关和足三里双穴多组条件下观察大鼠MIRI后恢复状况以及血管再生的变化。本研究中的实验结果表明,单刺内关或足三里均能有效升高大鼠左心室的LVEF和LVFS参数,而针刺双穴效果较针刺单个穴位更显著。此外,单刺内关或足三里穴位能够显著减缓大鼠的心肌梗死面积,而针刺双穴效果更为显著。

血管新生指在原有血管基础上生长形成新血管的过程,是机体对缺氧状态的一种自然响应过程[26]。血管新生可在MIRI早期抢救缺血心肌,恢复心肌细胞生长、存活和收缩功能,促进慢性左室重构,防止向心力衰竭过渡。心肌梗死再灌注后刺激血管新生有助于改善心脏灌注和心肌功能[27];增加血管新生能够提高梗死区域周边细胞存活率从而改善心室重构[28]。因此,血管新生在心肌缺血再灌注治疗中的作用越来越受到重视。然而,到目前为止,有前景的临床前研究未能满足临床试验的期望[29-30],这也进一步扩大了对新型促血管生成药物开发的需求。血管内皮生长因子VEGFA被广泛认为能够有效促进血管生成[31-32];CD31作为血管生成标记物被报道能够参与血管新生[33];α-SMA被认为是血管平滑肌细胞表型转化的标志[34-35]；eNOS通路激活能够促进血管新生[36-37]。本研究中,我们通过检测VEGFA、α-SMA、CD31和p-eNOS在各组大鼠心肌组织中表达确定针刺内关和足三里对血管生成的作用。结果发现针刺内关和足三里双穴的大鼠心肌组织中VEGFA, α-SMA、CD31和p-eNOS蛋白表达水平显著高于单刺内关和足三里穴位组以及MIRI对照组。实验结果证实,针灸内关、足三里双穴能有效促进大鼠MIRI后的血管重塑。

综上所述,针刺内关或足三里能够有效减缓大鼠的心肌缺血再灌注造成的心肌损伤,并且促进血管重塑,而针刺内关和足三里双穴能够达到比针刺单个穴位更佳的治疗效果。然而,当前研究也存在局限性。例如,本研究未探索针刺内关和足三里穴对MIRI后血管生成影响的具体机制。因此,课题组计划后续研究将围绕血管生成相关分子机制进行深入探索。