结核分枝杆菌抗压力反应表面蛋白研究进展

刘 宇

（云南医药健康职业学院，云南·昆明 650000）

据报道，2019 年，全球估算新发结核病例996万，其中141万死亡病例，排名前三位的结核病新发患者高负担国家分别是，印度（264 万），印度尼西亚（84.5 万），中国（83.3 万）[1]。由于艾滋病、吸毒、免疫抑制剂、酗酒与贫困等原因，结核病的发病率又呈上升趋势。结核病已成为艾滋病病人死亡的首要原因。结核杆菌可通过呼吸道、消化道及损伤的皮肤粘膜等多种途经侵入易感机体，2019年报道的新发结核病例中，合并艾滋病的病例占比为8.2%[1]。结核病可引起多种组织器官的感染。结核杆菌在在与宿主的长期作用中，进化出了一系列独特的抗压力反应功能，使其能够抵御巨噬细胞的吞噬和裂解而存活下来。结核杆菌既可以在细胞外存活，也可以在细胞内寄生。结核杆菌主要感染人体的巨噬细胞，其分泌的多种蛋白质成分在阻止巨噬细胞与溶酶体融合中起到重要作用。结核杆菌分泌的蛋白成分还可以干扰巨噬细胞的免疫反应，引起巨噬细胞的凋亡或坏死，从而使菌体自身得以生存[2]。在宿主免疫功能强大时，结核杆菌通过引起脂质成分的聚集，将自身包装成一种潜伏状态，从而避免机体巨噬细胞更强烈的免疫反应[3]。当宿主免疫功能低下时，处于休眠状态的结核杆菌迅速被调动起来，进入激活状态，继续繁殖和感染机体。因此，研究菌体分泌蛋白的抗压力反应机制，不仅有助于鉴定结核杆菌的致病基因，也为结核病的诊断和治疗提供新的技术手段和思路。还可以阐明结核杆菌潜伏感染的作用机理，为研制新型抗结核药物提供理论基础。结核杆菌表面蛋白RbpA、Cas2和PPE19是近年来研究比较热门的几种菌体表面蛋白。

一、结核杆菌表面蛋白RbpA

利福平作为重要的一线抗结核药物之一，其作用的靶点是结核杆菌负责基因转录的RNA 聚合酶。Paget 等在分离纯化天蓝链霉菌RNA 聚合酶时分离出一种新的RNA聚合酶结合蛋白，并将其命名为RbpA(RNAP binding protein)，并根据序列分析结果显示，该蛋白仅存在于放线菌中[4]。Rb⁃pA是能够与RNA聚合酶结合的蛋白质。

RbpA 与结核杆菌对利福平耐药之间存在密切关系，RNA 聚合酶的高表达与结核杆菌对利福平的耐药成正向相关。而RNA聚合酶的缺失或者基因突变则会导致菌体对利福平的敏感性增加。Chatterji 等对耻垢分枝杆菌的RbpA 蛋白的序列进行研究表明，过表达RbpA蛋白能明显增加其对利福平的耐药性，还利用Cross—link 方法证实RbpA 蛋白结合于RNA 聚合酶的D 亚基[5]。RbpA的蛋白序列结合位点与利福平的结合位点十分靠近。菌体对利福平的耐药机制可能的解释为RbpA是作为利福平的一种竞争结合蛋白而存在的[6]。而利福平与细菌的作用位点在空间结构上并不完全重合。因此推测，RbpA在利福平耐药中的作用，并不是通过与利福平作用位点直接结合的形式。

二、结核杆菌表面蛋白Cas2

噬菌体在自然界中广泛存在，结核杆菌依靠不断进化的抗压力反应机制来对抗噬菌体的威胁。CRISPR 系统（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）也是这一抗压力反应机制中的一员，它广泛存在于90%以上的古生菌和40%以上的细菌基因序列中[7]。对于结核分枝菌属而言，CRISPR 系统只存在于致病性结核分枝杆菌，属于致病菌对抗噬菌体的获得性免疫机制的一部分。而Cas2 基因则位于CRISPR 系统的前导序列，它不同于CRISPR系统中那些短的重复基因系列，它属于CRISPR系统基因序列中独特的一部分[8]。Cas2 基因表达蛋白包括解旋酶和核糖核酸酶等，表面蛋白Cas2 功能各不相同。结核杆菌表面蛋白Cas2广泛存在于含有CRISPR序列的微生物基因组中。Cas2 蛋白对于结核杆菌逃避巨噬细胞的免疫监视、抗压力反应以及抗生素抗性起着重要的作用。使用抗生素等可引起结核杆菌压力反应的试剂处理后，菌体内部的Cas2蛋白表达会发生明显变化[9]。

经过氨基酸序列的比对发现，Cas2 在致病性结核杆菌的的表达是高度保守的，说明Cas2可能对分枝杆菌的致病性是非常重要的。选择耻垢分枝杆菌作为实验菌株构建重组质粒，并将该重组质粒连接到耻垢分枝杆菌中，建立过表达Cas2的重组耻垢分枝杆菌模型[10]。并对重组耻垢分枝杆菌的Cas2 在压力反应以及毒力等方面的功能进行研究。进一步表明，Cas 蛋白与实验菌体的致病性高度相光。此研究为Cas 蛋白的机制提供了新方向，并为研究Cas2在结核分枝杆菌中的作用奠定了基础。

三、结核杆菌表面蛋白PPE19

结核分枝杆菌PPE家族基因作为抗原变异的来源及诊断血清，主要参与结核杆菌的毒力及抗压力反应中。结核分枝杆菌PPE 家族基因与宿主相互作用，发挥抗压力反应的作用越来越受到重视。PPEl9 基因作为PPE 基因家族的重要一员，其作用是调控结核杆菌抗压力反应因子SigB 的重要调控因子。实验表明，缺失或突变PPEl9基因的菌株对于抗生素、低氧、氧化压力等压力反应均表现出更加敏感。因此，作为SigB 因子的一个调控子而言，PPEl9基因可能对其中的一种压力因素或几种压力因素起到调控作用。

利用结核分枝杆菌基因组的PPEl9 基因构建重组质粒，将重组质粒转接到耻垢分枝杆菌中，构建表达PPEl9重组蛋白的重组耻垢分枝杆菌[11]。实验表明，PPEl9的过表达菌株也即菌体对抗压力反应的耐受菌株。这些抗压力反应包括，对抗饥饿条件，对抗酸性压力，对抗表面压力，对抗氧化压力以及对抗结核药物异烟肼的耐受。但是，PPEl9 基因仅在结核分枝杆菌的牛分枝杆菌中表达。而且，PPEl9基因对于耻垢分枝杆菌菌落形态，生物膜的形成等表面特性均未产生明显的影响。此外，PPEl9对于抗生素诺氟沙星表现出高度敏感。对于寄生于机体巨噬细胞内的胞内菌而言，PPEl9明显增强了耻垢分枝杆菌的存活，但是没有明显改变细胞内相关细胞因子的转录水平。

四、结语

肺结核是一种很古老的传染病，俗称是“痨病”，是一种对人类健康构成重大威胁的慢性传染病[12]。人类对结核杆菌感染率很高，虽然各国为防治结核病做出了大量努力，但是结核病依然在全球特别是中低收入国家中蔓延。近年来，科学界发现了一系列结核杆菌效应蛋白调控宿主细胞功能从而逃逸免疫清除的机制，揭示了病原菌与宿主间相互博弈的动态过程及分子机理，为抗结核治疗及药物研究提供了新思路和特异靶点。