慢性子宫内膜炎口服抗生素治疗前后的转录组测序研究

袁莹，陈雪梅*，刘容菊，何红梅，王静怡，邹志玲，周丽玲，陈博，李青洋，潘瑞华，蔡昭炜

(1.广东医科大学，湛江 524001；2.东莞市松山湖中心医院生殖中心，东莞 523326)

慢性子宫内膜炎(chronic endometritis，CE)是以子宫内膜间质区浆细胞浸润为特征的持续性、隐蔽性炎症疾病。早期认为宫颈粘膜可以提供一个不渗透屏障，阻止细菌从阴道进入子宫，从而维持子宫的无菌环境[1]。但采用细菌培养和宏基因组测序等方法发现子宫内存在大量的微生物，包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、葡萄球菌(Staphylococcus spp.)，甚至酵母菌等[2-3]。另外，研究发现抗生素(如多西环素、环丙沙星和甲硝唑等)的使用对CE具有较好的疗效[4]。因此，认为CE是由于微生物引起的，但其详细的诱发机制尚不清楚。

据统计，在育龄妇女中，CE患病率从8%至72%不等[5]。研究发现CE可造成子宫内膜的容受性受损[6]，导致自然妊娠和辅助生殖技术(ART)助孕的受孕率显著降低[7-8]。经抗生素治疗后可显著改善妊娠结局[9-10]。因此，CE的诊断和治疗对于不孕症极其重要。目前对CE的临床诊断主要有子宫内膜间质内浆细胞苏木素-伊红(HE)染色和免疫组化(IHC)染色。HE染色可以较好地区分具有嗜碱性细胞质的浆细胞，但是与成纤维细胞、单核白细胞、有丝分裂期细胞等较难区分，使得诊断结果受干扰[11]。当B细胞逐渐发育为浆细胞时，细胞表面会表达CD138[12]，因此基于CD138的IHC得以运用。相比HE染色，IHC的CE阳性检出率显著升高(56% vs.13%，P<0.01)[13]，但IHC缺乏统一的诊断标准，并且受实验环境的影响；因此，仍需要进一步寻找更加准确的标记物。

在本研究中，选取采用口服盐酸多西环素片及甲硝唑片治疗后转阴的25例CE患者，对治疗前后的子宫内膜进行转录组测序，筛选出差异表达基因，探讨抗生素治疗CE对子宫内膜基因的影响，基因层面解释CE治疗对恢复子宫内膜功能的作用。

资料和方法

一、研究对象

选取东莞市松山湖中心医院生殖医学中心2019年10月至2021年10月期间经一次新鲜或冻融胚胎移植失败后行子宫内膜活检诊断为CE的不孕不育患者25例作为研究对象。

纳入标准：(1)年龄<40岁；(2)病理诊断患有CE；(3)月经周期25～35 d，自身月经周期变化3 d内。

排除标准：(1)染色体核型异常；(2)自身免疫性疾病。

本研究获得东莞市松山湖中心医院医学伦理委员会批准。所有研究对象均签署知情同意书。

二、CE诊断与样本收集

1.CE诊断：采用HE染色及CD138 IHC染色的方法判断是否患有CE。IHC每高倍镜视野下至少有1个CD138阳性的浆细胞即诊断为CE[14-16]。

2.标本收集：患者月经干净3～7 d行宫腔镜下子宫内膜活检或直接使用一次性子宫内膜取样器抽吸子宫内膜，留取2份子宫内膜样本，其中一份用10%甲醛溶液固定后送病理检查，另外一份用DNA/RNA保存液于-80℃保存。

如患者病理诊断为CE，保存的样本进行转录组测序(治疗前)。诊断为CE的患者于月经期开始口服盐酸多西环素片100 mg(2次/d)及甲硝唑片400 mg(2次/d)，共服14 d，次月月经干净3～7 d使用一次性子宫内膜取样器抽吸子宫内膜，留取2份子宫内膜样本，保存方法及用途同前。如复查病理诊断无CE，则将子宫内膜样本进行转录组测序(治疗后)，如病理诊断仍有CE，则不进行测序，继续给予相同的抗炎治疗，直至复查子宫内膜病理诊断无CE，再将无CE的样本进行转录组测序。

三、50份样本的建库与测序

每份样品用3 μg的总RNA用于建库测序，建库方法按照NEBNextUltraTMRNA Library Prep Kit(NEB，美国)的说明书进行。文库构建完成后，先使用 Qubit2.0 Fluorometer(Life Technologies，美国)进行初步定量，稀释文库至1.5 ng/μl，随后使用 Agilent 2100 bioanalyzer(Agilent，美国)对文库的片段进行检测，当片段长度符合预期后，qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量(文库有效浓度高于2 nmol/L)，以保证文库质量。库检合格后，利用MGISEQ-2000(华大智造)测序。

四、数据质控与序列比对

使用fastp v 0.19.3 对原始数据(Raw reads)进行过滤，去除N(N表示无法确定碱基信息)的比例>10%的reads；去除低质量reads(质量值SQ≤5的碱基数占整个read长度50%以上的reads)获得过滤后的数据(clean reads)。使用HISAT v2.1.0构建索引，并将clean reads比对到人类参考基因组(https：//hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/chromosomes/)。

五、差异表达基因筛选

使用FeatureCounts v1.6.2对基因比对情况进行计算，然后根据基因长度计算每个基因的FPKM。采用DESeq2 v1.22.1软件进行基因表达水平和差异基因筛选，筛选条件设为：Padj<0.05(padj值是校正后的P值，该值越小表示基因表达差异越显著)且差异倍数的绝对值(|fold change|)>2。

六、差异表达基因的功能富集分析

通过KEGG数据库对差异表达基因进行功能富集分析，Padj<0.05表示显著富集。

结 果

一、CE患者的基本情况

25例患者均为经一次新鲜或冻融胚胎移植失败后行子宫内膜活检诊断为CE的不孕不育患者。所有患者的年龄为23～38岁，平均年龄(33.48±3.37)岁；体质量指数(BMI)为17.15～26.49 kg/m2，平均BMI(21.56±2.58)kg/m2；不孕年限从1年至11年不等，平均不孕年限(4.76±3.36)年。其中原发性不孕患者占40.0%(10/25)，继发性不孕患者占60.0%(15/25)。

25例患者中有20例经过1个疗程的抗炎治疗后复查CE治愈，4例经2个疗程治疗后复查治愈，剩下的1例经3个疗程治愈。1个疗程治愈率为80.0%，2个疗程治愈率96.0%，3个疗程治愈率100%。

25例患者经治疗后全部行辅助生殖技术(ART)助孕，经过1～3个周期胚胎移植，平均移植胚胎数1.5个。累计19例临床妊娠，累计临床妊娠率79.2%(19/24)；生化妊娠1例，生化妊娠率4.2%(1/24)；未妊娠率16.7%(4/24)；剩余1例尚未移植。

二、转录组测序质量控制

为探究口服盐酸多西环素片与甲硝唑片治疗对CE患者子宫内膜基因表达的影响，对25例CE患者治疗前和治愈后的子宫内膜(50份样本)进行转录组测序。首先进行测序质量评估，结果详见表1。每个样本平均获得(23.7±1.2)×106条原始数据(raw reads)，对原始数据过滤后得到(23.6±1.2)×106条高质量的测序数据(clean reads)，平均大小为(3.5±0.2) Gb。用Q20与Q30计算 Phred数值大于20、30的碱基占总体碱基的百分比，其平均值分别为(97.9±0.3)%和(94.4±0.7)%，表示本次测序具有较高的正确率。测序碱基中的GC含量的平均值为(49.6±1.6)%，最大值为55.7%，最小值为42.4%。平均(96.7±1.9)%过滤后的数据能够比对到人类基因组中，其中(93.3±3.5)%的数据可以比对到基因组的唯一位置。因此，本研究获得较高质量的测序数据。

表1 转录组测序质量评估

三、CE患者抗生素治疗前后子宫内膜的基因表达谱

转录组测序在50份样本中共检测到70 492个转录本，分别在不同的样本中表达。分析每个患者治疗前后的差异表达基因，得到差异基因的表达谱(图1)，每一列表示为一个样本的基因表达，表达量的高低分别由红色和蓝色表示。根据该结果，不同CE患者个体之间的基因表达具有较大的差异。

四、差异基因的筛选结果

根据筛选标准共筛选出29 510个差异表达基因，其中上调的有11 519个，下调的有17 991个。由于个体间的差异巨大，因此本研究将至少在14例CE患者中表达模式一致的差异基因划分为显著差异表达基因，以此为依据，共筛选出38个显著差异表达基因，其中20个基因在治疗后显著上调表达(P<0.001)，18个基因在治疗后显著下调表达(P<0.001)(表2、图2)。

图1 CE患者抗生素治疗前后差异基因的表达谱

表2 显著差异表达的38个基因信息

续表

A：抗生素治疗后显著上调的基因；B：抗生素治疗后显著下调的基因。图2 口服抗生素治疗CE前后的38个显著差异表达基因的相对表达量

五、差异基因的KEGG分析

对上调和下调表达的29 510个差异基因进行KEGG富集分析，分别得到富集程度最高的前20条通路。其中，上调表达的基因主要富集到与疾病相关的通路，包括神经性多疾病途径、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、人类乳头瘤病毒感染、沙门氏菌感染等疾病相关的途径(图3A)。而下调表达的基因富集到PI3K-Akt信号途径、MAPK信号途径、鞘脂类信号途径、甲状腺激素信号途径等以及一些疾病相关的途径(图3B)。上调表达的基因和下调表达的基因共同富集的途径包括人类乳头瘤病毒感染途径、细胞内吞作用、人T细胞白血病病毒1感染途径、粘着斑途径、内质网与蛋白加工、溶酶体等生物学途径。

六、显著差异基因功能分析

对筛选出的38个显著差异基因进行功能分析(表3)，其中上调的基因包括细胞周期蛋白D2(CCND2)与类MYB原癌基因2(MYBL2)等调控细胞周期进程的基因，也有免疫相关的凝血因子XIII A(F13A1)基因；在18个显著下调的基因中，大部分与组织损伤、细胞黏附与转移、肿瘤发生和细胞免疫相关，例如血浆铜蓝蛋白(CP)基因、纤连蛋白1(FN1)基因、金属肽酶7(MMP7)基因、血小板衍生生长因子受体基因(PDGFRA)和磷蛋白质分泌1基因(SPP1)等。因此，这些显著差异表达基因可能参与CE的发生过程。

A：上调表达基因；B：下调表达基因。气泡大小代表富集基因的数量，气泡越大表示富集基因数越多；颜色代表富集显著性，越接近红色表示富集越显著。图3 差异表达基因的KEGG分析

表3 显著差异表达基因的生物学功能描述

续表

讨 论

转录组测序可以比较直观全面地呈现器官组织在特定状态下基因的表达过程，已经广泛应用于人类生殖疾病方面的研究[17]。CE是发生在子宫内膜上的慢性疾病，通常情况下无症状或轻微症状。目前认为，CE是由于子宫内的细菌感染引起的，宏基因组学的研究表明大量的微生物存在子宫内，服用抗生素可以有效地治疗CE[18]。盐酸多西环素片与甲硝唑片已经用于CE的临床研究，但是关于其治疗前后子宫内膜的基因表达并没有报道。

本研究中首先用口服盐酸多西环素片与甲硝唑片治疗CE患者，并对治疗前和治疗后转阴的子宫内膜进行转录组测序。结果表明，大量与疾病相关的基因在治疗前与治疗后差异表达(图1和图2)。尤其一些治疗后下调表达的基因被富集到不同的炎症相关信号途径：(1)PI3K-Akt信号途径。PI3K-Akt途径一般参与氧化应激和炎症反应的调节，Nrf2是其下游的关键因子。有研究表明PI3K-Akt途径可激活Nrf2且在慢性阻塞性肺疾病(COPD)中发挥重要作用[19]；(2)MAPK信号通路。MAPK信号通路是介导细胞外信号到细胞内信号的重要信号转导途径之一，可调节细胞增值、迁移、炎症、凋亡等多种病理生理过程，一些研究报道称，药物治疗可通过MAPK信号途径减轻炎症反应，例如当归多糖通过MAPK信号通路减轻LPS诱导的真皮细胞炎症反应[20]；(3)鞘脂类信号途径。在哺乳动物中，鞘脂信号途径是指鞘脂水解产物神经酰胺(Cer)和鞘脂苷-1-磷酸(S1P)在多种细胞信号通路中发挥作用的过程[21]。多项研究表明，这些鞘脂介质，包括神经酰胺、神经酰胺-1-磷酸和S1P，可能在炎症中起着不可或缺的作用，并且有望成为新的治疗靶点。本研究结果中差异基因的KEGG分析提示，上述信号通路可能参与CE的发生。

在鉴定的差异表达基因中，根据至少在14例CE患者中表达模式一致原则，最终筛选到38个显著差异表达基因。上调的基因有转录因子，例如编码锌指蛋白的JAZF1，ETS家族的SPDEF以及编码MYB家族转录因子的MYBL2。有与癌症相关的基因，如编码癌症抑制因子的H19以及在人类癌症中经常活跃表达的IGFBP5等。另外还有一些与免疫相关的基因如F13A1，该基因编码的蛋白参与伤口愈合、免疫系统功能、维持妊娠、骨形成和新血管生长等方面。在这些治疗后上调的基因中，值得关注的是RASD1基因和OVGP1基因。CE患者通常会导致自然妊娠和ART助孕的受孕率显著降低。有研究报道，反复种植失败(RIF)患者表现为子宫内膜Ras信号通路的基因表达异常，且RASD1的表达水平显著降低。而在正常情况下，RASD1充当信号因子调节宫腔环境而促使胚胎着床成功[22]。OVGP1由子宫内膜上皮表达，胚胎植入时在管腔上皮细胞中被特异性诱导，它可调节子宫内膜容受性相关基因并帮助滋养层粘附[23]。Laheri等[24]发现RIF的女性子宫内膜中OVGP1显著降低。因此RASD1及OVGP1的表达水平有望成为CE治疗后是否恢复受孕能力的一个检测指标。在CE治疗后下调表达的基因中，炎症相关的基因如GPX3、NTN4和MMP7等均显著下调。GPX3编码的谷胱甘肽过氧化物酶可以催化过氧化物转化为水，研究表明GPX3参与牛磺胆酸抗炎反应[25]。NTN4编码一种与层粘蛋白相关的分泌蛋白和导向分子，存在于血管基膜中，研究发现这种分泌蛋白可提供一个对抗炎症的保护环境，阻止细胞因子的产生[26]。这些炎症相关因子的下调表达表明其炎症反应已经减轻。MMP家族基因通常在成年人的组织器官中低水平表达，然而当发生组织修复、炎症反应以及胚胎发育过程中，其表达量会显著上调[27]。根据以往的文献证据，我们推测CE抗生素治疗后炎症消退，MMP7的表达会随之下调。本研究中转录组测序结果显示抗生素治疗后的CE患者中MMP7显著下调，与先前的文献报道一致[24]。

本研究选取的研究对象为同一人群CE抗生素治疗前后的子宫内膜样本，可以最大程度地减少不同个体间的基因表达差异，但也有一定的局限性：由于未设置对照组，无法比较CE患者治疗前后与正常未患病人群的基因差异表达；另外，由于本研究用口服盐酸多西环素片和甲硝唑片治疗CE，不排除相关的基因表达差异存在药物特异性，服用不同药物治疗后基因差异表达谱可能不同。

综上所述，本研究利用转录组测序技术对口服抗生素治疗CE患者的子宫内膜基因表达进行分析。结果表明PI3K-Akt信号途径、MAPK信号途径与鞘脂信号途径可能参与了CE炎症反应过程。与治疗前相比，参与Ras信号通路的RASD1基因的表达水平在治疗后显著提高，它能够调节宫腔环境而促使胚胎着床成功。另外，一些抗炎相关因子基因GPX3、MMP7和NTN4的表达量均显著下调，表明其炎症反应已经减轻。

本研究可以对CE的治疗提供一定的临床依据，也为研究CE的发病机理提供一定的前期基础。在接下来的研究中需要进一步扩大样本量及完善空白对照组的基因测序及分析，并且对一些关键基因进行RT-qPCR验证，以进一步探索转录组测序在CE诊治中的临床价值。