自噬在多囊卵巢综合征中的调控作用研究

陈欢欢，张磊，张珊，崔趁趁，张翠莲*

(1.河南省人民医院生殖医学中心，郑州 450003；2.河南省生殖医学工程国际联合实验室，郑州 450003)

多囊卵巢综合征(PCOS)是一种常见且复杂的育龄期女性内分泌代谢性疾病，其临床表现为排卵障碍、高雄激素血症、肥胖及胰岛素抵抗(insulin resistant，IR)等，并与2型糖尿病、生育力下降及心血管疾病等远期并发症相关，占无排卵性不孕症的70%～80%[1]。随着人们生活方式的改变和环境因素的影响，PCOS的发病率和患病率均呈增长趋势，在育龄女性中的发病率高达5%～15%[2]。由于PCOS患者卵泡发育及排卵障碍机制不明，病因复杂多样加上遗传因素的可能，PCOS至今没有彻底治愈的方法，给患者带来了巨大的精神和经济压力[3]。自噬是细胞降解胞内成分(包括可溶性蛋白、蛋白聚集体、细胞器、大分子复合物和异物)重要的、保守的过程，上述物质首先被称为“隔离膜”的囊泡所包被，囊泡逐渐闭合形成双层膜结构，即自噬体，并最终与溶酶体融合后进行降解[4]。近年来，关于自噬参与PCOS发生的分子机制日益受到人们的关注[5]。本文总结了PCOS相关自噬的最新进展，期望为未来的研究提供参考和借鉴。

一、自噬概述

细胞降解主要有两种途径：蛋白酶体途径和自噬途径。蛋白酶体主要降解短寿命蛋白质，而自噬则负责降解长寿命蛋白质以及受损或多余的细胞器[6]。自噬是一种特定形式的细胞死亡(Ⅱ型程序性细胞死亡)，是细胞对内外压力反应的一部分。事实上，正常细胞很少发生大规模的自噬，除非存在诱发因素，既包括细胞外的胁迫如营养缺乏、缺血和缺氧，也有细胞内的因素如代谢应激、细胞器损坏、蛋白质的异常折叠或聚集[7]。由于这些因素的长期存在，细胞维持一个非常低的基础自噬活性，以维持细胞内稳态。

根据自噬的形态特征和分子机制，哺乳动物细胞的自噬可以分为三种主要类型：巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)。每种类型都有其独特的分子机制，并受到各种细胞信号的严格控制，有助于细胞适应不断变化的环境。根据底物选择性，自噬也可以分为两类：选择性自噬和非选择性自噬。非选择性自噬指的是细胞器或其他细胞质成分随机转运到溶酶体；选择性自噬是指对需要降解的特定底物的识别，并进一步分为以下几种类型：线粒体自噬、过氧化物酶体自噬、内质网自噬、细胞核自噬、核糖体自噬、脂自噬、聚集体自噬和异体自噬等。自噬是真核细胞的一种自我保护机制，在自我吞噬细胞物质的过程中，对受损的细胞器进行再加工或清除，从而维持细胞内环境的稳态，自噬失调参与多种疾病的发生[8]。

二、自噬标志物

自噬生物标志物在正常生理、病理过程或药物的药理反应中作为自噬的指标发挥着重要作用。在自噬的整个过程中有不同的自噬相关基因(autophagy-related gene，Atg)参与自噬发生的不同阶段。

1.Atg12-Atg5复合体：在经典的泛素理论中，泛素作为一个前体产生，随后被特定的蛋白酶切割，暴露某些羧基末端甘氨酸残基。然后泛素被泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)激活，并通过硫酯键的形成转移到泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme，E2)。泛素连接酶(ubiquitin ligase，E3)在确定靶蛋白后，通过泛素的甘氨酸和靶蛋白的赖氨酸残基之间的连接，将泛素分子从E2酶转移到靶蛋白[9]。Atg12是第一个被鉴定的类泛素Atg蛋白。自噬相关蛋白Atg7是一种E1样激活酶，Atg10是一种E2结合酶。Atg12首先被Atg7激活，转运到Atg10后与底物蛋白Atg5的赖氨酸残基共价连接，形成Atg12-Atg5复合物，此过程中不需要底物特异性E3连接酶。Atg12-Atg5复合体的形成不受诸如营养缺乏等环境压力的影响，它的存在对自噬体的形成至关重要。

2.Atg16L1：螺旋状蛋白Atg16L1与Atg12-Atg5复合物相互作用，通过寡聚化形成Atg12-Atg5-Atg16L1复合物[10]，在自噬前体膜的延伸中发挥作用。Atg12-Atg5-Atg16L1复合物粘附在自噬体表面，主要分布在膜的凸起部位，而在膜的凹部分布较少，即Atg12-Atg5-Atg16L1复合体主要位于自噬体膜的外侧。在自噬体结构完全闭合后，复合物从自噬体膜中释放出来，并在细胞质中重新分布，而分布在膜两侧的Atg8-PE留在自噬体膜上，并被运输到溶酶体，与溶酶体融合后降解。综上所述，在自噬体延伸过程中，Atg16L1定位于早期自噬膜上，而不存在于自噬溶酶体膜上。因此，Atg16L1可以被用来检测早期自噬体的形成。

3.Atg8/LC3：Atg8/LC3是目前自噬研究中应用最广泛的分子生物标志物。在酵母中，Atg8与磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)结合形成Atg8-PE。在哺乳动物细胞中，Atg8的同源物包括微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3，MAP1LC3/LC3)和γ-氨基丁酸受体相关蛋白(γ-aminobutyric acid receptor-associated protein，GABARAP)。LC3参与自噬体膜的形成，GABARAP参与自噬体膜的延伸和闭合[11]。MAP1LC3/LC3蛋白包括LC3A、LC3B、LC3B2和LC3C，其中LC3A和LC3B具有较高的同源性。LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ是两种可以相互转化的LC3[12]。细胞中新合成的LC3首先被加工成LC3-Ⅰ，以可溶性形式存在于细胞质中。然后，泛素化的LC3-Ⅰ与存在于自噬体膜表面的PE结合，形成膜结合的LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ分布在自噬体膜上，是自噬过程的重要生物标志物，LC3-Ⅱ含量或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值与细胞自噬体数量呈正相关，可用于评估细胞自噬水平。

4.Beclin-1：哺乳动物中的Beclin-1含有450个氨基酸残基，相对分子量为60 kD，主要位于高尔基体的反面、内质网和线粒体上。Beclin-1蛋白有4个重要的结构域：Bcl-2同源结合域(BH3)、螺旋结构域(CCD)、进化保守结构域(ECD)和核输出信号结构域[13]。Beclin-1通过其ECD结构域与磷脂酰肌醇3激酶催化亚基3型(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit type 3，PIK3C3/Vps34)结合形成Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)复合物，而磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基4(phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit 4，PI3KR4/Vps15)可以将Vps34固定在细胞膜上。Vps34磷酸化磷脂酰肌醇，产生的磷脂酰肌醇3-磷酸(phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P)能够结合自噬前体膜上的其他自噬相关蛋白。Beclin-1在调控自噬起始的信号转导途径中发挥作用。在正常条件下，Beclin-1与Bcl-2相互作用，自噬被抑制。当细胞处于应激条件时，促凋亡分子BH3从Bcl-2中分离出Beclin-1[14]，然后Beclin-1与Ⅲ类磷脂酰肌醇-3激酶PIK3C3/Vps34结合激活自噬。

5.p62/SQSTM1：p62也被称为SQSTM1(sequestosome 1)，是一个相对分子量为62 kD的自噬受体，作为底物在自噬过程中被降解[15]。p62在多种细胞和组织中表达，并作为支架蛋白参与多种信号转导过程。免疫组化结果显示p62的定位与LC3的定位重叠。p62可以通过其LC3-相互作用区与LC3结合，并通过泛素相关结构域(ubiquitin-associated domain，UBA)与含有泛素的蛋白质结合。p62及其结合的泛素化蛋白包含在自噬体中，并在自噬溶酶体中降解。当自噬受到抑制时，自噬体积累，p62水平升高。因此，p62可以作为自噬的一个标志物，其水平的高低反映了自噬活性程度。

三、PCOS相关内分泌代谢中自噬的调节

1.高雄激素参与PCOS自噬调节：高雄激素血症是女性无排卵最常见的原因之一，并增加了PCOS患者内分泌紊乱的风险[16]。自噬在内分泌功能障碍和无排卵中起着重要作用。探讨高雄激素血症与自噬的关系有助于了解PCOS的发病机制。

高雄是PCOS的临床特征之一。雄激素对自噬的调节可能在PCOS的发病机制中发挥了重要作用。研究者收集PCOS患者和非PCOS患者的颗粒细胞，发现Beclin-1的表达水平与血清总睾酮和雄激素水平呈正相关；在非PCOS患者的颗粒细胞中添加二氢睾酮(dihydrotestosterone，DHT)，Beclin-1的表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值呈剂量依赖关系[16-17]。表明雄激素诱导的自噬激活可能在PCOS的发生发展中发挥重要作用。

Song等[18]在脱氢表雄酮(DHEA)诱导的PCOS小鼠模型中研究了mTOR复合物1(mTOR complex 1，mTORC1)在调控骨骼肌自噬中的作用，研究发现DHEA处理后mTORC1激活(mTORC1磷酸化)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值降低、SQSTM1的表达增强，即自噬水平降低；同时，在体外培养的C2C12小鼠成肌细胞中添加睾酮激活mTORC1，自噬减少、线粒体功能受损、发生胰岛素抵抗；相反的，抑制mTORC1诱导自噬，线粒体功能得到恢复，胰岛素敏感性增加。这项结果表明mTORC1-自噬通路可能通过损害线粒体功能、降低胰岛素敏感性参与雄激素诱导的青春期前雌性小鼠骨骼肌的胰岛素抵抗。

Cui等[19]在DHT诱导PCOS大鼠模型中揭示了雄激素通过诱导肝脏细胞凋亡和自噬参与非酒精性脂肪肝的分子机制，研究发现DHT诱导的PCOS大鼠肝脏中促凋亡因子Bak的mRNA水平升高，活性caspase-3与caspase-3前体的比值增加；自噬相关蛋白Atg12的表达增加，但是LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的mRNA水平和蛋白水平均降低，且自噬底物p62的表达在两组中也没有显著差异。这项研究结果表明自噬在DHT诱导的PCOS大鼠中没有显著增加，但是存在自噬失衡现象。

2.自噬调节PCOS胰岛素抵抗：PCOS不仅是一种内分泌紊乱，也是一种代谢紊乱，各种代谢异常在PCOS的进展中起着至关重要的作用[20]。大约50%～75%的PCOS患者存在不同程度的胰岛素抵抗[21]。因此，了解PCOS胰岛素抵抗的分子机制很有必要。

有研究采用来曲唑诱导PCOS大鼠模型，在口服来曲唑15 d后开始同时口服纳米姜黄素(一种新型的姜黄素纳米脂质体制剂)，研究纳米姜黄素调节PCOS模型鼠胰腺自噬的分子机制[22]。研究发现PCOS组性激素水平紊乱，血糖、胰岛素水平显著升高，表现出胰岛素抵抗，同时发现PCOS组miR-223-3p的表达水平下降、自噬标记物p62和LC3-Ⅱ的蛋白水平升高；加入纳米姜黄素后miR-223-3p的表达水平上调，异常升高的自噬得到恢复，血糖含量和血清胰岛素水平降低，胰岛素抵抗减弱。结果表明，纳米姜黄素可通过上调miR-223-3p，抑制自噬，减轻胰岛素抵抗。

已有研究证明柚皮素和桑色素对自噬具有协同调控作用[23-24]。mTOR信号通路在自噬过程中发挥极为重要的作用。mTOR包含两种复合体，分别为mTORC1和mTORC2。研究者设计了对照组、PCOS组、PCOS+柚皮素组、PCOS+桑色素组、PCOS+柚皮素+桑色素组5组实验，其中PCOS组大鼠连续注射胰岛素，诱导高胰岛素血症和胰岛素抵抗[25]。结果发现添加柚皮素和桑色素后，与PCOS组相比血清胰岛素水平降低，mTORC1、mTORC2和p62的蛋白水平降低，LC3-Ⅱ、Caspase-3的蛋白水平升高。该研究结果表明柚皮素和桑色素可能通过mTOR信号通路增强自噬降低PCOS大鼠胰岛素抵抗。

还有研究采用来曲唑联合高脂乳剂构建PCOS胰岛素抵抗大鼠模型，之后添加不同剂量的桂枝茯苓丸，探讨桂枝茯苓丸致PCOS-IR大鼠排卵障碍的分子机制[26]。结果发现，模型组卵巢组织中PI3K、p-Akt和p-MTOR蛋白的磷酸化水平均降低，自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1的相对表达量显著升高；添加桂枝茯苓丸后，p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白水平均升高，在中、高剂量组中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Atg5和Beclin-1的相对表达量显著降低。该研究结果表明桂枝茯苓丸可通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路，抑制卵巢组织过度自噬，改善卵巢功能和胰岛素抵抗，且高剂量效果更佳。

3.炎症诱导PCOS自噬增强：研究表明，炎症因子在PCOS患者中高表达，如白介素18(interleukin 18，IL-18)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素6(interleukin 6，IL-6)、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和巨噬细胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)[27]。PCOS患者存在持续的低度慢性炎症，与高雄激素血症、高胰岛素血症和肥胖等相关，加重了PCOS患者的病理变化。

TNF-α在肥胖型PCOS患者和非肥胖型PCOS患者的血清中表达量均升高；在PCOS患者中，TNF-α的升高引起胰岛素敏感组织中胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)丝氨酸磷酸化增加，使胰岛素敏感性葡萄糖转运蛋白(glucose transporter type 4，GLUT4)的表达下降，最终发生胰岛素抵抗[28]。CRP是肝脏受IL-6刺激后产生的急性期反应物，IL-6是一种来自脂肪组织的内分泌细胞因子。有研究表明，CRP是PCOS中最可靠的慢性低级别炎症标记物，在PCOS患者中的表达量升高，且非肥胖PCOS患者中CRP的表达量低于肥胖PCOS患者[29]。IL-6在卵巢发育和胚胎着床过程中发挥重要作用，影响排卵和妊娠结局[30]。

作为一种细胞内降解途径，自噬保护细胞免受包括感染在内的外源性危害，以及包括分子聚集和受损细胞器在内的内源性炎症。PCOS患者体内炎症因子增加，表明自噬可能通过调节炎症参与调控PCOS患者胰岛素抵抗或者排卵障碍过程。

高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)是一种炎症介质，在2型糖尿病患者中通过糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)和toll样受体(toll-like receptors，TLRs)激活核转录因子kappa B(NF-κB)信号通路参与炎症反应[31]。NF-κB是细胞中重要的转录调节因子，参与炎症反应，在PCOS患者中异常高表达[32]。近年来，HMGB1在调节卵巢内自噬中的作用受到关注，它能够诱导颗粒细胞的自噬反应，导致颗粒细胞数量下降。HMGB1通过作用于自噬蛋白增强自噬，包括增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和ATG7水平以及降低SQSTM1水平[33]。

四、PCOS患者卵巢颗粒细胞的自噬

颗粒细胞作为卵巢组织的重要组成部分，在卵泡的生长发育过程中发挥着至关重要的作用。随着卵泡发育至窦卵泡期，颗粒细胞分化为在空间和功能上不同的2个种群，即围绕在卵母细胞周围的卵丘细胞和排列在卵泡壁上的壁层颗粒细胞。卵丘细胞主要为卵母细胞的生长发育提供营养和能量，而壁层颗粒细胞主要承担内分泌功能。这些细胞通过分泌营养物质和激素来促进初级和次级卵泡的生长和发育，从而为卵母细胞在卵泡中进行减数分裂和成熟提供适宜的微环境。颗粒细胞凋亡导致卵巢激素合成减少，从而降低卵泡卵母细胞的生长发育，诱导卵母细胞凋亡[34]。颗粒细胞的自噬与凋亡密切相关，影响PCOS患者的胚胎质量和妊娠结局。

Qin等[35]用DHT构建小鼠PCOS模型，自然交配后收集后代小鼠的卵巢组织，免疫组化染色结果发现LC3-Ⅱ在PCOS后代小鼠卵巢中的表达高于对照组，透射电镜结果显示PCOS后代小鼠颗粒细胞中自噬体的数量增加。这些结果表明PCOS后代小鼠卵巢中的自噬水平显著增加。研究者进一步将模型小鼠的卵巢组织进行了甲基化测序分析，发现MAPK通路上的Map3k1(编码MEKK1)和自噬通路上的Map1lc3a(编码LC3-Ⅱ)启动子区甲基化水平降低，并伴随着Map3k1和Map1lc3a的表达水平上调，且MAPK通路上的自噬相关基因Beclin-1的表达量也上调；另外，将小鼠颗粒细胞用DHT处理后，发现Map3k1、Map1lc3a和LC3-Ⅱ的表达水平显著上调，并伴有Map3k1的甲基化水平下调[35]。该研究结果表明DHT可能通过调节Map3k1的甲基化和表达水平，导致MAPK信号通路的激活，进而影响颗粒细胞自噬水平。

二甲双胍是PCOS治疗中应用最广泛的药物之一，可以改善胰岛素敏感性，恢复PCOS患者的排卵功能，促进胚胎着床，提高妊娠率。二甲双胍可通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制氧化应激诱导的自噬[36]，但二甲双胍对PCOS患者卵巢颗粒细胞的作用机制尚不清楚。研究者用二甲双胍治疗来曲唑构建的PCOS模型大鼠，发现PCOS组卵巢组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1的表达以及氧化应激水平高于对照组和PCOS+二甲双胍组；然后，收集大鼠的颗粒细胞，用H2O2处理后建立氧化应激细胞模型，并用二甲双胍处理模型细胞，发现H2O2+二甲双胍组中LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-PI3K的表达低于H2O2组，且PI3K/AKT/mTOR通路干扰组(H2O2+3-MA、H2O2+LY294002和H2O2+Rapa)中AKT磷酸化(p-AKT)和mTOR磷酸化(p-mTOR)水平低于H2O2+二甲双胍组；此外，加入PI3K和mTOR抑制剂后，Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高[37]。该研究结果表明，二甲双胍能够通过PI3K/AKT/mTOR通路降低氧化应激改善PCOS颗粒细胞自噬。

已有大量研究表明异常表达的miRNA在PCOS发病机制中起重要作用，对PCOS有潜在的诊断价值[38]。在卵丘卵母细胞复合物(cumulus oocyte complex，COCs)和KGN细胞(人卵巢颗粒细胞)中let-7家族是表达最丰富的miRNAS，并参与调节妊娠、卵泡发育、卵母细胞成熟和激素反应[39-40]。研究者发现let-7e在PCOS患者颗粒细胞中异常高表达，并利用KGN细胞系探究了let-7e影响颗粒细胞功能的分子机制[41]：抑制let-7e后发现LC3-Ⅱ水平升高，p62水平降低，p21的表达被激活；相反，过表达let-7e后LC3-Ⅱ水平降低，p62水平增加，p21的表达被抑制；同时也发现在PCOS患者颗粒细胞中LC3-Ⅱ和p21蛋白水平下降。因此，该研究结果表明let-7e可能通过抑制p21信号通路调节PCOS颗粒细胞的自噬。

五、小结与展望

正常情况下，自噬是维持卵母细胞发育、卵泡生长分化、卵泡闭锁和生殖周期所必需的。相关研究表明由于受影响的细胞类型不同，自噬可能会以激活或抑制的状态参与PCOS的发展。例如，在人、大鼠或小鼠的卵巢组织、胰腺组织和颗粒细胞中，自噬是显著激活的；而在PCOS小鼠的骨骼肌中，自噬是被抑制的；另外，在PCOS大鼠的肝脏组织中自噬相关蛋白的表达变化不一致，结果导致整体自噬没有显著增加。自噬参与PCOS患者的高雄激素血症、胰岛素抵抗、慢性炎症等内分泌代谢调节过程，并通过调节卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡降低卵母细胞质量，导致排卵障碍和不孕不育；同时，PCOS动物模型或患者使用的调节药物也可以通过自噬发挥作用。因此，完善PCOS的自噬模型，探究自噬在PCOS中的作用机制，可为进一步了解PCOS的发病机制以及药物治疗提供新的思路和方法。