中性粒细胞胞外陷阱在糖尿病视网膜病变中作用的研究进展△

陈洪良 施 健 娄雪莹 俞 莹

糖尿病是由胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗等原因引起的全身慢性代谢性疾病,在代谢性疾病中有非常重要的地位。由高血糖引起的糖尿病性视网膜病变(DR)是糖尿病微血管病变最主要的表现之一[1]。DR晚期出现的视网膜新生血管可能会引起玻璃体积血、牵拉性视网膜脱离等严重并发症,是发达国家人群致盲的主要原因,其发病机制尚不明确[2-3]。研究表明,DR与天然免疫系统激活下的慢性低度炎症状态密不可分[4-6]。中性粒细胞作为人体内数量最多的白细胞,构成了机体对抗微生物病原体的第一道防线。中性粒细胞胞外陷阱(NETs)是一种最新发现的中性粒细胞杀菌机制,在血管损伤、创伤愈合、肿瘤的生长和进展、肾盂肾炎中均发挥重要作用,同时也积极地参与了DR的发生发展过程[7]。因此,本文就NETs形成及其在DR中作用的研究进展做一综述。

1 NETs的形成

在健康成人中,中性粒细胞是体内数量最多的白细胞类型,占循环白细胞的50.0%～70.0%,同时也是最常见的非特异性免疫反应的中心细胞[8-9]。中性粒细胞杀菌的机制除了最经典的吞噬作用外,还存在一种自杀性的袭击方式,这就是最新被发现的中性粒细胞网捕死亡(NETosis),也称为可溶性或自杀性NETosis。这种程序性细胞死亡始于表面受体的激活,该程序会在几个小时内完成,并执行4项关键任务,包括细胞质膜的渗透,细胞骨架和细胞核包膜的分解,染色质的解致密化以及抗菌蛋白在染色质支架上的组装,最终形成的网状结构称为NETs[10]。这种新型的死亡方式不同于细胞凋亡和细胞坏死,没有细胞凋亡后磷脂酰丝氨酸途径及凋亡信号,也没有细胞坏死后肌动蛋白、微观蛋白等结构蛋白[11]。高分辨率扫描电子显微镜显示,NETs由直径为15～17 nm的光滑细丝堆叠组成的,在这个细丝骨架上布满了直径约为50 nm,由20多种颗粒蛋白组成的球状结构域,如肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)、中性粒细胞弹性酶(NE)、组织蛋白酶G、瓜氨酸化组蛋白3(Cit-H3)、蛋白酶3(PR3)、髓过氧化物酶(MPO)等[12]。PAD4能够催化中性粒细胞组蛋白瓜氨酸化,诱导中性粒细胞染色质解凝并释放到细胞外捕获病原体。NETosis过程开始后,NE向细胞核迁移并且破坏组蛋白。由于MPO可直接导致中性粒细胞DNA与组蛋白解离[13],所以,这一过程可能受到MPO的影响而减弱[14]。MPO和NE共同促进活性氧(ROS)进入线粒体,介导线粒体功能障碍,加速ROS形成,诱导NETs的形成[15]。

除了这种自杀性NETosis,还存在一种生存性NETosis,与自杀性NETosis不同的是,染色质解致密化后会通过小泡排出,而中性粒细胞由于吞噬等其他功能而存活,在产生NETs后仍能继续起到吞噬细胞的作用[16]。

2 NETs的机制

NETosis的发生依赖于多种细胞外刺激,其中包括病原体、自身抗体、细胞因子、免疫复合物、有丝分裂原、激素、氧化应激成分、热休克蛋白等[17]。NETs作用机制的不同很大程度上取决于刺激的类型。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶介导的ROS通路是NETs发生的经典核心机制。PAD4、钙离子载体(A23187)、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌或B组链球菌刺激中性粒细胞时,NADPH氧化酶复合物释放两个电子并转移到O2,形成超氧阴离子O2-,它可以自发或被超氧化物歧化酶(SOD)催化转化成过氧化氢(H2O2),H2O2又被MPO转化为次氯酸[18],ROS(O2-、H2O2、OH-等)在刺激后20 min 内会快速增加,使中性粒细胞发生氧化应激,进一步引起线粒体功能障碍和大量细胞核空泡化,导致细胞内染色质解凝和细胞质膜破裂,最终排出细胞外形成NETs来捕获相应的病原体[19]。Arai等[20]利用尿酸促进中性粒细胞内ROS的转化清除,结果发现,低浓度尿酸能抑制NADPH氧化酶的活性,减少NETs的产生,而尿酸浓度增高时会通过核因子κB(NF-κB)这一信号转导途径诱导NETs的产生。

Fuchs等[11]利用葡萄糖氧化酶产生的H2O2刺激中性粒细胞来模拟NADPH氧化酶下游的激活。中性粒细胞被刺激90 min后可检测到DNA的释放,NE和DNA-组蛋白复合物表达增加,这表明,在没有NADPH氧化酶参与下同样可以产生NETs。慢性肉芽肿患者体内携带NADPH氧化酶突变基因,因此,不能激活NADPH氧化酶。分离培养慢性肉芽肿患者血清中的中性粒细胞后发现,无论是被细菌还是佛波12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)刺激(即刺激NADPH氧化酶的上游)均不能生成NETs,但当这些中性粒细胞受到H2O2刺激时,也就是刺激NADPH氧化酶下游,则会产生NETs[21]。因此,即使在 NADPH 氧化酶被抑制或缺乏的情况下利用H2O2刺激也可以产生NETs。根据NETs形成过程中对ROS的需求表明,ROS在NETosis中作为第二信使,激活NADPH氧化酶及下游信号,最终导致NETs形成[22]。

另一种类型的NETosis是不依赖NADPH氧化酶所产生的ROS,而是通过电压依赖的钙通道开放,进而激活小电导钙激活钾(SK)分子的SK3通道,这种类型与SK3通道的开放密切相关,SK3可以直接控制NETs的形成[23],该研究也证实了中性粒细胞可以在不激活NADPH氧化酶复合物的前提下形成NETs。

3 NETs在糖尿病中的作用

高血糖会刺激中性粒细胞产生超氧化物和多种细胞因子,有利于NETosis的发生。研究发现,糖尿病患者血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平升高,刺激中性粒细胞形成NETs,并释放细胞内的中性粒细胞丝氨酸蛋白酶,包括NE和PR3,因此,在1型糖尿病患者的血清中能够检测到NE和PR3的水平和酶活性均有所升高[24]。升高的NE和PR3能够募集中性粒细胞至炎症部位,形成负反馈调节,加重自身免疫性糖尿病,因此,在1型糖尿病患者中会出现中性粒细胞减少,而NETs的增加就是其中一个重要的原因。高糖还能刺激中性粒细胞产生白细胞介素-6(IL-6)和TNF-α,这些增加的细胞因子又能促进中性粒细胞的氧化应激,更有利于NETs的产生[25-26]。

Joshi等[25]研究了高血糖如何调节NETs释放,结果发现,高血糖能减弱脂多糖(LPS)诱导的中性粒细胞脱颗粒作用,导致嗜氮颗粒MPO和NE的释放减少;与非糖尿病患者相比,糖尿病患者血清中NE酶活性降低,这表明糖尿病期间NETs的重要蛋白成分出现了功能障碍;在20 mmol·L-1糖浓度下,中性粒细胞在没有LPS刺激的情况下产生NETs,而在30 mmol·L-1糖浓度下,中性粒细胞DNA网状结构瓦解,NETs结构破坏,对LPS刺激失去反应,这表明中性粒细胞在高血糖条件下能够成型活化,降低了对外部刺激的反应能力,这样的NETs负反馈调节机制使得糖尿病患者更容易受到外部感染。另一项研究发现,与低糖浓度(5 mmol·L-1)相比,暴露于高糖浓度(25 mmol·L-1)的非糖尿病个体的中性粒细胞更容易发生自发性的NETosis,由于非能量糖不影响NETosis,因此,这一现象可能是通过糖酵解途径增加ROS的产生进而激活下游途径导致的[27]。在人类和小鼠糖尿病模型的研究中发现,中性粒细胞受到LPS、PMA或IL-8刺激后会出现细胞内钙离子的增加,并且用钙离子载体离子霉素和A23187治疗能够诱导NETs的释放[28]。

有研究显示,与正常对照组相比,1型糖尿病和2型糖尿病患者体内的中性粒细胞中PAD4蛋白表达水平增加了4倍,正是这些PAD4蛋白催化中性粒细胞产生NETs,这表明PAD4蛋白的增加可能有利于染色质解凝,但目前尚不明确高糖能否在转录或翻译后水平促进PAD4蛋白的表达;在高PAD4的刺激下,糖尿病患者体内的中性粒细胞更易形成NETs结构,在糖尿病小鼠模型中,如果PAD4的活性缺失,NETs的形成会被阻断[26]。在2型糖尿病患者的血清中,NETs相关的生物标志物NE、单核苷酸体、寡核苷酸体和双链DNA(dsDNA)均增加,并与糖化血红蛋白水平呈正相关,dsDNA又与肾病和心血管疾病的发生相关。此外,2型糖尿病患者的血清中,IL-6浓度更高,并与血清dsDNA水平相关,这提示NETosis在高血糖和炎症之间的相互作用中有重要意义[27]。有研究表明,在糖尿病患者中,血糖的增加可诱导更多的NETs形成[29],而且与糖尿病类型无关[30]。通过dsDNA和MPO的共定位检测发现,糖尿病患者胰腺中浸润的中性粒细胞能够释放NETs,主要是由于组蛋白瓜氨酸化促进了染色质解凝,导致NETs的释放[31]。

4 NETs在DR中的作用

DR是糖尿病患者常见的微血管并发症[32],其病理生理机制尚不完全清楚,但糖基化的终产物、多元醇的积累、蛋白激酶C的激活和中性粒细胞诱导的氧化应激与炎症反应均被认为是导致DR的危险因素[33-34]。DR的特征是组织缺血、缺氧引发血管生长因子的生成和炎症因子的释放,引起视网膜新生血管,并发生纤维化形成视网膜纤维血管增殖膜,严重的情况下患者会发生出血或牵拉性视网膜脱离[35-37]。为了研究NETs在DR中的作用,Park等[38]检测了PDR患者玻璃体中dsDNA的含量,dsDNA是在NETs产生后释放出来的产物,是检测NETs的重要指标,结果显示,与有糖尿病但无DR的患者相比,PDR患者玻璃体中的dsDNA浓度显著升高;此外,在体外高糖(30 mmol·L-1)刺激下,中性粒细胞会产生更多的DNA-组蛋白复合物和NE,并且NETs的标志物DNA-组蛋白复合物和NE是衡量炎症反应严重程度的指标。Wang等[39]研究中,根据视网膜病变的程度将糖尿病患者分为不同阶段,结果发现,与无DR的糖尿病患者相比,有DR的糖尿病患者外周血中NE、dsDNA的产生水平显著升高。Barliya等[40]研究发现,将IL-8或TNF-α注射到小鼠玻璃体内会导致小鼠视网膜中性粒细胞浸润,同时在小鼠视网膜上也发现了NE、MPO和Cit-H3等NETs标志物的阳性表达。

在NETs的形成过程中,中性粒细胞释放的游离DNA表面带负电荷,可激活凝血因子XII,裂解前激肽酶产生激肽释放酶,进而裂解高分子量激肽原(HK)为缓激肽(BK)和裂解的高分子量激肽原(HKa)。HK能够诱导中性粒细胞聚集并释放NE和O2-,并加重损伤。BK通过缓激肽受体B2(B2R)和细胞黏附分子刺激细胞内信号转导,引发急性炎症反应。而HKa有多种活性,与中性粒细胞表面受体巨噬细胞表面分子抗原Mac-1结合,刺激产生TNF-α、IL-1β和NE以及O2的释放,从而引起组织的慢性炎症。由此可见,NETs通过激肽释放酶-激肽系统(KKS)通路参与了DR的急性和慢性炎症损伤过程[41]。Song等[42]也在DR患者玻璃体内检测到了DNA-组蛋白复合物和XIIa的高水平表达,证实了高糖不仅能诱导NETs的形成,还能激活KKS通路加重DR的炎症损伤。

研究发现,中性粒细胞募集产生NETs还与DR的血管重塑有关。氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜上缺氧的血管内皮细胞发生衰老,分泌细胞因子并触发中性粒细胞产生NETs,促进消除衰老血管内皮细胞,进而为重塑视网膜血管做好准备[43]。通过敲除小鼠PAD4基因,能够削弱小鼠中性粒细胞产生NETs的能力,进而抑制衰老细胞的清除,延缓病理性新生血管的消退。因此,NETs既可参与诱导炎症和血栓形成过程,也可参与糖尿病诱导的血管病变的发展[19,44]。

Liu 等[45]研究显示,糖尿病小鼠视网膜中有大量中性粒细胞聚集并释放NE,NE可以通过蛋白酶激活受体(PAR2),髓样分化因子初次应答基因88(MyD88)和NF-κB等细胞因子增加血管内皮细胞通透性,进而加重了视网膜血管的渗漏。在缺乏NE的糖尿病小鼠中视网膜血管通透性显著降低,这说明,NETs能够提高DR小鼠视网膜血管通透性,导致视网膜水肿。

5 NETs在DR治疗中的应用

NETs的形成标志物DNA-组蛋白复合物和NE是DR的独立危险因素,这一发现为通过抑制NETs形成来防治DR提供了新的治疗和预防方法[46],这意味着可以通过抑制或阻断NETs通路中的标志物来延缓DR的发生发展,但这一过程尚需进一步的研究证实。研究发现,在不同的疾病如急性心肌梗死、中风和糖尿病中阻断PAD4能够控制糖尿病的进展[47],这也为进一步治疗DR提供了事实依据。Weitz[48]研究通过阻断NE能够减轻视网膜血管通透性,为减轻患者视网膜水肿,提高视力提供了新的治疗靶点。NADPH氧化酶介导的ROS是NETs形成的经典机制,利用抑制性药物PMA抑制NADPH氧化酶的活性,可以抑制中性粒细胞内染色质解凝,进而减少NETs生成,减轻组织的氧化损伤,因此,抑制NADPH氧化酶活性的药物开发或可用于DR的防治[21]。凝血系统中XIIa因子启动的KKS通路是NETs引起炎症的重要机制,XIIa因子的抑制剂(反义寡核苷酸、重组蛋白、合成肽和小分子量因子XIIa抑制剂)均已证实可以拮抗血栓的形成[42],深入研究XIIa抑制剂在NETs中的作用将进一步拓展这些药物的适应证,可能为DR的防治提供新思路。

6 结束语

NETs通过参与炎症反应在DR发生发展过程中起到了重要作用。了解NETs在DR中的发生及作用,并利用NETs形成过程中所产生的生物标志物,如组蛋白、MPO、NE和DNA-组蛋白复合物等能够判断DR的进展程度,同时也为DR的防治提供了新的靶标及思路。