糖尿病视网膜病变相关标志物的研究进展△

张春会 查 旭 张远平

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病(DM)微血管病变中最严重和最常见的并发症之一,随着DM患病率的不断增加[1],DR的患病率也呈现上升趋势。数据显示,我国DM患者中DR患病率约为22.4%[2],且存在种族和地域差异[3]。目前,DR的确切致病机制尚未完全明确,临床依据其特异性的眼底改变可分为非增生型DR(NPDR)和增生型DR(PDR)两阶段,而糖尿病性黄斑水肿(DME)可出现于病程的任何阶段[4]。既往研究表明,良好的血糖、血压、血脂管理在DR防控中发挥重要作用,然而单独预测DR风险的能力有限[5-6]。常规的临床治疗方案,如眼内注射抗血管内皮生长因子(VEGF)和类固醇药物、视网膜激光光凝治疗,治疗周期较长,费用昂贵,且部分患者的治疗效果不佳,病程后期往往还需联合玻璃体切割术[7]。病情严重的患者还可能出现失明[8]、认知障碍[9],甚至增加心血管疾病的发病风险[10]。而及早发现和干预被认为是减少患者视力损害的关键[11],因此,寻找并发现能够预测DR发生的影像学和生物学标志物显得至关重要。

1 DR的影像学标志物

1.1 眼底彩色照相相关诊断标志物

眼底彩色照相是一种快速有效的DR筛查方法,2002年制定的基于7个标准化的30°眼底彩色照相的国际DR分期标准已被广泛认可并应用于临床诊断和治疗中[4]。Muraoka等[12]研究证实,眼底彩色照相显示的患者视网膜小静脉扩张与DME发病相关。然而操作的复杂性限制了其在临床筛查或基层医院的广泛应用。随着现代超广角(UWF)眼底成像系统的出现,给视网膜疾病的快速诊断带来了曙光。UWF在单个视野中可捕获涡静脉前最少100°的视网膜图像,相较于传统的眼底照相能更好显示周边区域的病变,从而更准确地预测DR的活动[13]。

1.2 荧光素眼底血管造影相关诊断标志物

自1961年引入荧光素眼底血管造影(FFA)后,因其在显示视网膜无灌注区、新生血管和血管渗漏等细节信息中的高敏感性,一直被认为是视网膜血管系统疾病的金标准成像手段。有研究通过比较轻度至中度NPDR患者的眼底彩色照相和FFA特征发现,FFA对DR的检测准确率高于眼底彩色照相,同时FFA的检测结果更有助于及时发现眼底彩色照相遗漏的周边部病变[14]。随着影像学技术的不断革新,超广角荧光素血管造影(UWFA)技术逐渐进入人们的视野,它通过新型的自动微血管瘤计数技术证明了微血管瘤数量的增加与DR严重程度之间存在关联[15]。还有研究发现,PDR患者中央与周边无灌注指数均大于NPDR患者,中央无灌注区面积扩大与患者黄斑中心凹下视网膜厚度增加和视力下降相关[16]。尽管其属于有创操作,造影剂还可能引起过敏反应,但它依旧作为评估DR严重程度的一个最精准有力的工具,尤其在威胁视力的DR(VTDR)患者或有临床意义的黄斑水肿(CSME)患者的诊断或激光光凝治疗中更具优势。

1.3 光学相干断层扫描相关诊断标志物

光学相干断层扫描(OCT)可对视网膜和脉络膜的各个层次进行高质量无创性成像,临床常用于视网膜疾病的诊断和监测治疗反应。通常将黄斑中心凹1 000～3 000 μm区域[17]内层视网膜结构紊乱(DRIL)看作是DME较为可靠的标志物,定义为正常的神经节细胞层-内丛状层复合物、内核层和外丛状层结构紊乱,OCT表现为相邻结构的边界模糊。DRIL可反映视觉信息从光感受器到神经节细胞途径的破坏。有研究显示,它的存在可能是DR患者黄斑区域视网膜毛细血管出现无灌注区的可靠预测指标[18]。DR患者还表现为外层视网膜结构的改变。Maheshwary等[19]研究显示,视网膜内外节(IS/OS)和外界膜连续性破坏可作为DR患者视力恢复欠佳的预测因子。OCT上视网膜各层次出现的界限清楚的高反射点与小胶质细胞的活化和积聚有关,提示视网膜活动性炎症的存在,被视为是DR患者视力预后不佳的生物标志物[20]。在OCT上外界膜(ELM)和椭圆体带完整性的破坏[21]、黄斑中心凹下神经视网膜脱离[22]等改变也受到了临床医生的关注并可作为DR发生发展或监测治疗反应的可靠标志物。作为供给部分外层视网膜血供的脉络膜,其解剖结构或血管系统的破坏也可能影响患者视网膜功能。Ünlu等[23]对DR患眼进行研究发现,黄斑中心凹下脉络膜厚度与DR的严重程度呈正相关。脉络膜血管指数(CVI)被认为是评估脉络膜血流灌注情况相对稳定的指标,有研究发现,DR患眼的CVI与健康眼相比显著降低,且随着DR严重程度的加剧,CVI明显降低[24],提示CVI的改变可作为DR存在或进展的一个可靠标志物。关于脉络膜改变对DR 的影响目前存在较多争议,临床仍需进一步研究,探索更为准确的评估DR发生发展的临床影像学标志物。

1.4 光学相干断层扫描血管造影相关诊断标志物

光学相干断层扫描血管造影(OCTA)是新兴的一种无创视网膜微血管可视化方法,可显示黄斑中心凹无血管区(FAZ)、视网膜浅层和深层毛细血管丛的血管信息。一些定量指标,如血管密度、血管直径指数、分形维数、无灌注区面积和FAZ的面积/圆度等均已被应用于DR临床标志物的筛选。Memon等[25]的研究表明,浅层视网膜的血管密度和灌注值随着DR严重程度的增加而降低,并可能存在FAZ不规则改变,其面积也随着疾病严重程度的增加而增加。Lei等[26]研究发现,DR患者的视网膜毛细血管和大血管的反应不同,视网膜大血管直径每增加1 μm,DME发病率将增加1.9倍,而浅表毛细血管扩张1 μm,椭圆体带破坏的发生率则增加3.9倍,考虑可能与视网膜高灌注引起的小动脉和小静脉扩张所导致的黄斑水肿有关,并认为毛细血管的血管直径是DR分期的潜在可靠指标[27]。然而,OCTA在识别微血管渗漏方面不如FFA灵敏,且操作过程中要求患者的配合度较高,否则可能存在伪影,一定程度限制了其临床运用的范围。

1.5 人工智能在DR诊断中的应用

面对庞大的DR患者群体,仅依靠有限的眼底病专科医生难以有效应对临床上DR的筛查、诊断、随访等需求。随着机器学习的迅猛发展,国内外学者已广泛聚焦于人工智能(AI)在眼底疾病的应用,并在DR检测方面取得了卓越的成绩,突显了其在DR筛查方面的超高效力[28]。有研究结合影像学检查系统将AI技术与传统的专家诊断对比发现,AI系统同传统的专家诊断具有较高的一致性,并认为AI可应用于初级医疗机构的筛查工作[29]。此外,国外一项前瞻性多中心研究评估了由美国食品药品监督管理局批准的基于云视网膜诊断软件的自动DR检测系统(EyeArt),结果显示,通过分析眼底彩色照相上的DR改变,该系统在早期轻度DR和晚期VTDR检测方面具有较高的安全性和准确性,能广泛改善非眼科专业医护人员对DM患者的DR筛查和监测[30]。然而,尽管AI在DR筛查中的优越性已得到了较多认可,但在临床工作中仍面临较多的挑战,如数据获取、分析指标、机器算法、经济效益、相关的法律和道德问题。但是,随着AI技术的不断更新,凭借其独特的优势定会突破重重阻碍服务于临床,为DR患者的诊断和治疗提供帮助。

2 DR相关分子生物标志物的研究进展

DR是多因素作用所导致的疾病,仅单一的致病因素尚不能全面地解释其发病机制。随着DR患病率的增加,高通量的组学技术从多因素水平探索DR的致病机制成为热点,以寻找更加精准的DR风险预测标志物。

2.1 基因组学分子标志物

DM属于多基因遗传病,连锁分析、候选基因关联和全基因组关联研究均表明,遗传因素在DR的发病中起着重要作用,寻找DR发病易感基因引起了较多关注[31-32]。据估计,DR的遗传率为27.0%,而PDR的遗传率则高达52.0%[33]。Li等[34]通过甲基化芯片评估2型DM患者的超过85万个基因位点,首次在2型DM患者中检测到与DR相关的差异甲基化区域和差异甲基化位点(DMS),结果显示,S100A13基因中的DMS是DR的潜在生物标志物。叶酸主要在细胞分裂和分化中起作用,其中亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T的紊乱将会导致多种疾病的发生。一项基于我国人群的荟萃分析表明,MTHFR C677T多态性增加了DR的患病风险[35]。随着新一代全基因组外显子测序技术、数据分析的发展和研究样本的扩增,基因组学研究将有助于发现新的生物标志物和治疗靶点。

2.2 转录组学分子标志物

转录组学是从RNA水平研究生命体基因表达的情况,随着测序技术的逐渐成熟,测序结果提供了更加精确和全面的DR早期分子标志物。由于DR早期的组织学标志是选择性周细胞丢失,Rangasamy等[36]运用RNA测序和qPCR分析对DM小鼠模型中分离的视网膜周细胞进行转录组学分析,差异表达分析显示,217个基因,如ext2基因、B3gat3基因、Gpc6基因、PIP5K1C基因和Pten基因表达显著上调,495个基因,如NOTCH3基因、XBP1基因、Gpc4基因、Atp1a2基因和AKT3基因表达下调,并进一步验证了NOTCH3基因在DR小鼠血-视网膜屏障改变中的作用。Shao等[37]则通过转录组学分析经低糖、高糖环境处理后人视网膜内皮细胞,获得和转甲状腺素蛋白(TTR)相关的非编码RNA(LncRNAs)和mRNA,首次构建了LncRNA-mRNA调控网络,并获得了853个TTR-mRNAs和48个TTR-LncRNAs,其功能涉及细胞周期、细胞凋亡、炎症信号通路、氧化应激反应、新生血管和自噬,并证实LncRNAs MSTRG.15047.3和LncRNAs AC008403.3在DR患者房水和血清中的表达水平均显著高于正常对照组,LncRNAs FRMD6-AS2的表达水平显著低于正常对照组。

2.3 蛋白质组学分子标志物

技术的进步使得以全面的蛋白质性质研究为基础的高通量蛋白质组学研究成为可能,通过检测诸如房水、泪液、血清和玻璃体液等生物体液可以发现相关生物标志物。Song等[38]研究发现,DR患者房水中白细胞介素(IL)-6、IL-8、IL-10、VEGF、转化生长因子-β(TGF-β)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等8种细胞因子在疾病发生发展中发挥一定作用,并可作为判断DR严重程度的生物标志物和潜在治疗靶点。此外,泪液中的脂质运载蛋白1抗体、乳转铁蛋白、溶菌酶C、内毒素、脂蛋白A和免疫球蛋白λ链[39-40]等也参与DR的进展。由于泪液未与视网膜系统直接接触,能否通过检测泪液蛋白成分来预测视网膜病变情况尚存在争议。但考虑到DR患者视网膜血管系统的改变可以调节泪液的分泌,即使它未与视网膜直接接触,一定程度上也可反映视网膜的改变。温德佳等[41]通过液相色谱-串联质谱技术分析了28例PDR患者和4例玻璃体混浊患者的玻璃体,并经过通路富集分析发现,Chemerin、Sema 4B、ApoB和HSP70可作为防治PDR的新靶点。通过全面揭示组织或细胞内蛋白质的表达状况,临床已运用蛋白质组学技术发现了多种疾病的分子标志物。因此,灵敏度高、特异性强的蛋白质组学技术的迅速发展有望为寻找可预测DR风险的潜在标志物提供有力的理论依据和解决途径。

2.4 脂质组学分子标志物

脂质组学不仅提供关于单个脂质本身的信息,还提示特定脂质缺乏对整个生物体的影响[42]。有研究表明,DR与脂质代谢紊乱高度相关[43]。Koehrer等[44]将对照组和不同阶段的DR患者红细胞膜进行脂质体分析,结果显示,各阶段DR患者红细胞磷脂和多不饱和脂肪酸均低于对照组。早期DR患者的主要病理特征是视网膜微血管高通透性,Ibrahim等[45]通过对人视网膜内皮细胞脂质体进行筛选发现,12/15-脂氧合酶可能通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶依赖机制参与DR的发生。脂质作为一种能量储存形式,参与细胞活动的调节,由于脂质分子结构具有多样性、复杂性等特点,目前对脂质代谢网络和功能调控机制的研究不够深入。随着精准医学时代的到来,脂质组学将被广泛应用于生物标志物的发现和研究调控DR的病理生理机制。

2.5 代谢组学分子标志物

代谢物被认为是基因表达的终产物,与细胞的营养状态及其他外界因素的影响密切相关,反映了细胞所处的环境,通过对代谢产物的深入研究,可以判断机体的状态。代谢组学是对某一生物或细胞在某一特定生理时期内所有低分子量(相对分子质量<1 000)代谢产物同时进行定性和定量分析的一门新兴学科,借助高通量检测和数据处理手段,以信息建模与系统整合为目标的系统生物学的一个分支[46]。Jin等[47]基于核磁共振的代谢组学研究方法,在老年性白内障、老年性白内障合并DM或DR患者的房水样本中发现了25种主要代谢物,进一步的代谢通路分析显示,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢在DR的发生发展中活性较高,因此,临床可结合患者房水中一些小分子代谢物的改变来预测老年性白内障或合并DM患者术后DR发生发展的风险。Wang等[48]则运用气相色谱-飞行时间质谱联用方法在DR患者和非DM患者的玻璃体和房水样本中发现了11种新的代谢产物,并通过代谢通路分析阐述了糖异生、抗坏血酸-醛酸代谢、缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸生物合成和精氨酸-脯氨酸的代谢异常在DR病程中的作用,认为它们可能为发现预测DR的诊断标志物和探索发病机制提供新的方向。但考虑到房水、玻璃体等生物样本获取过程的有创性,一定程度上限制了其在临床筛查中的广泛应用。国外有研究对DR患者和DM对照者的血浆样本进行了非靶向代谢组学分析,结果显示,126项代谢特征存在显著差异,而通路分析显示,精氨酸、瓜氨酸、谷氨酸半醛和脱羟基肉碱是造成这些途径差异的关键代谢物[49]。代谢物作为基因组学的下游产物,最接近疾病表型,通过检测DR患者的某些代谢产物寻找DR早期的生物标志物可开发一种较为完善的疾病诊断方法。

2.6 多组学技术在DR中的应用

随着测序技术、质谱分析和生物信息学分析等技术的飞速进步,组学技术已广泛应用于眼科领域,极大地推动了眼科学的发展,然而由于多因素疾病的复杂性,单一的组学技术并不能全面解释疾病的发病机制。因此,采用先进的高通量测序和质谱等组学技术,整合多组学的数据和知识,系统地以动态、交互的思想揭示生命活动规律。有研究已将所取得的数据资源作为公开数据库向公众开放[50],这一举措改变了单一组学研究的局限性。也有研究将肠道微生物组学和代谢组学技术相结合研究发现,PDR患者的肠道细菌丰度和菌群多样性显著降低,而微生物分类多样性的丧失常被认为与系统性炎症有关[51]。Wang等[52]整合转录组学和蛋白质组学的方法,在大鼠和人类的视网膜中均发现了miR-143显著富集,并通过调节细胞基质黏附和调节缺氧诱导因子-1信号通路对内皮细胞活性产生负面影响,参与DR视网膜新生血管的形成。然而,一系列挑战也随着多组学技术的发展应运而生,如由于原始数据量庞大往往需要专业的生物信息人员先进行预处理、缺乏对跨组学研究的计算及分析方法等。因此,还需要进一步的努力来发现和验证生物标志物作为诊断DR的有力工具,以便深入理解其发病机制从而创造早期个性化干预的机会。

3 结束语

机体长期处于高血糖的状态下时2型DM患者最终可并发DR,然而,由于经济或认知原因尚存在一些未被确诊的2型DM患者,往往以视力下降等眼部症状首诊于眼科,这可能会导致部分患者错失最佳治疗时机。因此,寻找能够预测DR发生发展的相关影像学和生物分子标志物对于患者的筛查、治疗和随访均非常重要。考虑到生物过程本身的复杂性,单一的标志物难以全面准确地预测DR发生发展,应结合多组学技术及相关影像学标志物从而开发出更精准的可预测DR发生发展的特异性标志物,最大程度地保留患者的视力并减轻家庭及社会的经济负担。