乳酸菌发酵剂对杂粮面团及馒头品质的影响

谢水琪，张晓桐，靳奇文，刘利军，孟祥晨

（东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030）

馒头是中国北方人民日常食用的面制品。随着人们消费水平的提升，人们不仅要吃得饱，而且要吃得好。传统的白面馒头具有高血糖生成指数的特点，并不适合所有人食用[1]。大部分杂粮属于低血糖生成指数食品，含有优质的植物蛋白，氨基酸组成模式也优于精制小麦粉[2-3]。因此，将杂粮代替精制小麦粉用于研发低血糖生成指数的优质食品已经成为食品领域的研究热点。

目前，杂粮食品存在的主要问题是适口性不佳，且杂粮中存在诸多的抗营养因子，如植酸、单宁等[4]，严重影响了杂粮食品的营养品质和感官接受度。然而，乳酸菌发酵杂粮能够改善杂粮制品的感官接受度，降解抗营养因子，提升营养特性[5-6]。乳酸菌作为一种具有益生作用的微生物，通常是以发酵剂的形式应用到产品中[7]。有研究报道，乳酸菌作为发酵剂发酵杂粮不仅可以提升杂粮的营养品质，还可以降解豆类蛋白，提升蛋白质体外消化率[8]。De Pasquale等[9]在鹰嘴豆半液体面团中添加乳酸菌Plantibacillus plantarumT0A10进行发酵，结果表明鹰嘴豆面团中抗性淀粉（resistant starch，RS）和总游离氨基酸含量显著升高。另外，乳酸菌发酵能够明显改善杂粮面团（multigrain dough，MD）的营养及感官品质[10-11]。Li Li等[12]发现使用乳酸菌预发酵麦麸加入面团中，对面包的整体特性有积极影响。因此，乳酸菌发酵剂可应用于杂粮制品品质和营养的提升。

本研究拟利用混合乳酸菌发酵剂发酵杂粮面团（fermented multigrain dough，FMD），探究发酵处理对OBG、RS及游离氨基酸含量的影响，分析不同面团的微观结构差异，同时对馒头的营养及感官评价进行评估，旨在开发广阔的杂粮资源，提升MD及杂粮馒头（steamed multigrain bread，SMB）的品质，为更多杂粮制品的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄豌豆（经蒸熟干燥粉碎后过60 目筛制成豌豆粉）马培中食品股份有限公司；莜麦（经粉碎后过60 目筛制成莜麦粉） 惠牛农业（北京）有限公司；高筋小麦粉 河南新乡市新良粮油加工有限责任公司；谷朊粉 安徽安特食品股份有限公司；燕麦β-葡聚糖（oatmealβ-glucan，OBG）（食品级） 欣烁生物科技有限公司；直投式发酵剂RP80（植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌）和YO-PROX-700（嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌） 普尔斯（天津）国际贸易有限公司；乳酸、乙酸标准品（色谱纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型） 碧云天生物技术有限公司；SAKURA 4583型樱花OCT冷冻切片包埋剂、淀粉含量定量试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；葡萄糖含量定量试剂盒 南京建成科技有限公司。

1.2 仪器与设备

HM730型和面机 青岛汉尚电器有限公司；SPL-150型恒温培养箱 天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；2695高效液相色谱仪 美国Waters公司；TA.XT plus型质构仪 英国Stable Micro Systems公司；UV-1500C型紫外-可见分光光度计 上海美析仪器有限公司；LA-8080型氨基酸分析仪 日本日立公司；TCS SP8型激光共聚焦显微镜 德国莱卡公司。

1.3 方法

1.3.1 面团的制备

FMD：将直投式发酵剂RP80和YO-PROX-700按照1∶1的比例混合，以0.15%接种量接种至杂粮粉基质（豌豆粉与莜麦粉添加量均为16.00%，谷朊粉添加量22.86%，OBG添加量2.29%）水分添加量42.85%，使用和面机将面团揉制光滑，于37 ℃发酵24 h，即得FMD。

MD：杂粮粉基质配比与FMD一致，不添加乳酸菌发酵剂。

1.3.2 面团pH值、可滴定酸度（total titratable acid，TTA）测定

参照马子琳等[13]的方法。

1.3.3 有机酸的测定

参照曹伟超等[4]的方法。

1.3.4 OBG含量的测定

参照NY/T 2006—2011《谷物及其制品中β-葡聚糖含量的测定》的方法并稍作修改。分别称取FMD与MD的冻干粉末0.01 g于2 支玻璃试管底部，向试管中添加0.2 mL 50%乙醇溶液，于旋涡混合仪上振荡6 s，分散后加入4.0 mL的磷酸钠缓冲溶液（20 mmol/L、pH 6.5）充分振荡；将试管放入沸水浴中保持1 min，旋涡振荡6 s后沸水浴中保持2 min，继续旋涡振荡处理数秒处理备用；将处理好的样品放置50 ℃中保温10 min，加入0.2 mL 50 U/mL葡聚糖酶溶液，振荡6 s后50 ℃水浴60 min，在此期间取出试管振荡处理3～4 次；水浴后添加5 mL 200 mmol/L乙酸钠缓冲溶液，混合均匀，室温冷却10 min，3000 r/min离心10 min，分别取0.1 mL上清液至2 支试管底部，向其中1 支添加0.1 mL 2 U/mLβ-葡萄糖苷酶溶液，另一支试管添加0.1 mL 50 mmol/L乙酸钠缓冲溶液作为空白。将上述试管在50 ℃保温10 min，用葡萄糖定量试剂盒测定其中葡萄糖含量。OBG质量分数（干基）计算公式如下：

式中：G为葡萄糖定量试剂盒测定所得葡萄糖含量/μg；94为体积校正因子（9.4 mL取0.1 mL用于分析）；W为固体样品质量/g；0.9为葡萄糖转化样品为OBG的脱水转换因子。

1.3.5 RS含量的测定

参考Muir[14]和任娜梅[15]等的方法并稍作修改。取FMD、MD两种面团冻干粉末，具体操作步骤如下：1）精确称取100 mg干燥磨粉后的样品于试管底部，加入4 mL酶混合溶液（包含10 mg/mL胰α-淀粉酶和3 U/mL淀粉葡萄糖苷酶），旋涡混匀。2）水平放置于恒温培养箱中，与运动方向平行，37 ℃、200 r/min处理16 h。3）加入4 mL无水乙醇，旋涡混匀，3000 r/min离心10 min。4）转移上清液，用2 mL 50%工业酒精（industrial methylated spirits，IMS）（含甲醇1%）悬浮沉淀并3000 r/min离心10 min，取沉淀并加入6 mL 50%的IMS溶液，混匀并3000 r/min离心10 min，合并上清液，重复此步骤2～3 次。5）在吸水纸上倒置试管，吸干水分。6）向沉淀中加入磁转子和2 mL 2 mol/L的氢氧化钾溶液，冰水浴搅拌并重悬浮沉淀20 min。7）边搅拌边向混合液中加入8 mL醋酸钠缓冲溶液（pH 3.8），并立即加入0.1 mL 3300 U/mL淀粉葡萄糖苷酶溶液，50 ℃水浴处理30 min，期间间歇混匀。8）将7）中的混合液直接8000 r/min离心10 min，用葡萄糖定量试剂盒测定上清液中的葡萄糖含量（G）。RS质量分数=G×0.9。

1.3.6 激光共聚焦显微观察

分别取1 g FMD、MD，用冷冻包埋剂处理并固定于冷冻切片机专用托盘，-80 ℃冷冻1 h。将固定好的样品切成15 μm薄片并置于黏附载玻片上，用丙酮为溶剂配制质量分数为0.025%罗丹明B和0.25%的异硫氰酸荧光素溶液，对切片染色1 min后用去离子水脱色，盖上盖玻片并用指甲油固定四周，置于激光共聚焦显微镜放大200 倍观察。

1.3.7 游离氨基酸的测定

参照曹伟超等[4]的方法。

1.3.8 馒头的制作

馒头的配方如表1所示，制作流程：主料与辅料的准备与称质量→原料调粉均匀→杂粮面粉其中一组使用发酵剂发酵（37 ℃、24 h）后3 种原料中均加入0.5%的安琪酵母溶液混合均匀→一次发酵（37 ℃、30 min）→分割搓圆→二次发酵（37 ℃）至体积1.5～2 倍大小→冷水上锅蒸25 min。

表1 馒头配方Table 1 Formulations of steamed bread

1.3.9 馒头的营养评价

1.3.9.1 馒头比容和质构的分析

比容：将制成的馒头置于室温冷却1 h，采用小米置换法测定馒头的体积，比容/（mL/g）=体积/质量。

质构：参考Kou Xuerui等[16]的方法并稍作修改，馒头冷却1 h后，用切片刀将馒头切成厚度为15 mm的馒头片，取中间两片，做3 个平行样。利用质构仪进行测定，测试条件设定为：探头P/35型，压缩率为50%，两次压缩间隔5 s，测前、测间、测后速率均为1 mm/s，起点感应力为10 g。

1.3.9.2 总淀粉含量的测定

使用淀粉含量定量试剂盒测定。

1.3.9.3 蛋白质含量的测定

参照曹伟超等[4]的方法。

1.3.9.4 蛋白质体外消化率的测定

参照罗昆等[17]方法并稍作修改。取1 g馒头芯囊的冻干样品，加入15 mL 20 mg/mL的胃蛋白酶溶液（盐酸调节pH 1.5），37 ℃振荡2 h。用0.2 mol/L NaOH溶液将pH值调节至7.0，加入15 mL 5 mg/mL胰蛋白酶溶液，37 ℃振荡1.5 h。加入5 mL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液，混匀静置1 h，10000 r/min离心15 min保留上清液。采用BCA试剂盒测定上清液中的蛋白质含量，体外蛋白消化率/%=上清液中蛋白质含量/样品中蛋白质含量×100。

1.3.9.5 膳食纤维含量的测定

参照GB 5009.88—2014《食品中膳食纤维的测定》进行。

1.3.9.6 馒头的感官评价

馒头制作完成后，挑选10 名具有一定感官评定经验的学生（男女比例为1∶1）对馒头的质地、口感、外观等进行打分评价，评分标准见表2。

表2 馒头感官评分标准Table 2 Criteria for sensory evaluation of steamed bread

1.4 数据处理

利用Excel 2013与GraphPad Prism 9.0进行数据处理及图表绘制，所有数据均以表示，实验重复3 次以上，SPSS 22进行方差分析。P＜0.05，差异显著；P＜0.01，差异极显著。

2 结果与分析

2.1 FMD pH值、TTA及有机酸的变化

乳酸菌酸化过程可显著提升面团中抗营养因子的降解以及营养物质的部分水解，研究酸化过程具有重要意义。由图1a可知，面团在前10 h内迅速酸化，随后逐渐平缓，在20 h达到稳定。图1b表明，pH值降低是因为直投式发酵剂中的乳酸菌发酵过程中释放乳酸和乙酸为主[18]，发酵24 h，乳酸和乙酸质量浓度分别达到24.85 mg/mL和8.98 mg/mL，且有继续上升趋势，相比于乳酸，乙酸的缓冲范围更广，酸碱滴定时可以消耗更多的碱液[19]，因此相比预期的TTA值更大。另外乳酸菌的发酵过程形成的低pH值环境能够有效延长食品保质期，提升产品品质[20]。

图1 FMD发酵过程中pH值、TTA（a）及有机酸（b）的变化Fig.1 Changes in pH,TTA (a) and organic acids (b) during fermentation of sour dough

2.2 面团中OBG和RS的含量变化

OBG作为一种可溶性膳食纤维，通过乳酸菌发酵其在MD中含量是否发生变化值得探索。此外，RS在人体消化道中能够抵抗淀粉酶的消化，具有较低的胰岛素反应，且有一定可溶性膳食纤维的功能，对人体益处广泛[21]，故本实验着重研究OBG和RS含量的变化。由图2可知，在直投式发酵剂中乳酸菌的发酵作用下，相比MD，FMD中的OBG含量下降32.56%，RS含量上升32.88%，说明乳酸菌在发酵过程中显著降低了MD中OBG含量，这可能是由于OBG是一种可溶性膳食纤维，在发酵过程中受到乳酸菌的降解作用[22]；但是发酵过程显著提高了杂粮粉面团中的RS含量，与De等[8]研究结果一致。FMD中RS和OBG含量变化与最终产品的血糖生成指数及营养品质有关[21]。

图2 发酵前后MD中OBG和RS含量的变化Fig.2 Changes in OBG and RS contents in multigrain dough before and after fermentation

2.3 面团微观结构的观察

利用激光共聚焦显微镜研究乳酸菌发酵对面团微观结构的影响，淀粉被染成绿色，蛋白质被染成红色，黄色是由绿色和红色结合产生（图3）。FMD中的蛋白质和淀粉相互作用更明显，说明乳酸菌发酵能够显著提升MD中淀粉与蛋白质相互作用，相比MD，FMD中的面筋网络结构更加紧密，间隙区域明显减少，这可能是因为乳酸菌发酵过程中降解了豌豆蛋白和莜麦蛋白，且大分子纤维素发生降解，这些都有利于面筋网络的形成[23]。此外，图3中a、b所示处可能是莜麦细胞，在前期处理过程中，莜麦细胞保持完整，周围边缘部分是细胞壁，细胞壁里空洞部分可能是未被染色的淀粉颗粒[24]。从图3可以看出，相比MD，FMD中大颗粒细胞体明显减少，说明乳酸菌发酵可能对植物细胞有一定的降解能力[25]。

图3 发酵前后MD激光共聚焦微观结构图Fig.3 Confocal laser scanning micrographs of multigrain dough before and after fermentation

2.4 面团中游离氨基酸的含量

面团中的游离氨基酸代表其营养价值，MD中蛋白质在乳酸菌发酵作用下发生水解，有利于游离氨基酸的释放。由图4可知，FMD经过24 h发酵后，游离氨基酸总量（203.08 mg/100 g）是MD的1.46 倍；必需氨基酸占总游离氨基酸比例也明显升高，从MD的17.86%提高到30.68%。赖氨酸作为谷物中的第1限制性氨基酸，在谷物中含量极低，且在谷物加工中易分解[26]。经过乳酸菌发酵后FMD中赖氨酸含量是MD的5.43 倍。本研究表明，在乳酸菌发酵作用下能够显著提升MD游离氨基酸含量，优化MD中游离氨基酸的组成模式。

图4 发酵前后MD中游离氨基酸含量Fig.4 Contents of free amino acids in multigrain dough before and after fermentation

2.5 馒头比容和质构分析

比容和质构是评价馒头质量的客观指标，也是消费者选择产品的重要依据。比容越大代表馒头质量越好。由表3可知，与SMB相比，SFMB的比容显著提高，且接近于SWB。馒头的比容取决于面团中二氧化碳含量及面团自身的流变学特性[27]，乳酸菌在发酵过程中分解大分子蛋白和纤维素，提高面团的延展性，使得面筋网络结构更加紧密，利于二氧化碳的积累[28]。质构仪测试结果表明，乳酸菌发酵显著降低SMB的硬度和咀嚼性，但是SMB和SFMB的弹性、黏聚性及回复性无显著差异。由图5可知，SFMB气室显著比SMB更加均匀且细小，且接近于SWB，馒头更加蓬松，颜色方面也有所改善，这可能是乳酸菌在发酵过程中降解了大分子蛋白和纤维素，促进了面筋蛋白二硫键的形成[28]，该结果也从侧面验证了面团的微观结构结果。

表3 馒头的比容和质构分析Table 3 Specific volume and texture properties of steamed bread

图5 不同馒头的切面图Fig.5 Cross-sections of different steamed bread samples

2.6 馒头的营养成分及感官评价分析

由表4可知，相比SMB，SFMB中总淀粉和蛋白质含量有所下降，但差异不显著，说明乳酸菌发酵对淀粉和蛋白质含量的影响不明显。SFMB和SMB的总膳食纤维质量分数均高于6%，符合GB 28050—2011《预包装食品营养标签通则》对于高膳食纤维食品的定义，MD经过乳酸菌发酵后，总膳食纤维显著降低，可溶性膳食纤维升高，但差异不显著。难溶性膳食纤维显著降低，原因可能是乳酸菌在发酵过程中把难溶性膳食纤维降解为可溶性膳食纤维，并将可溶性膳食纤维降解为葡萄糖等小分子加以利用[29]。因此，SFMB的难溶性膳食纤维降低为SMB的2.26 倍。乳酸菌在发酵过程中能够激活杂粮机制中的天然纤维酶，其中内切葡聚糖酶可将难溶性膳食纤维长链降解为可溶性小分子膳食纤维[30]。蛋白质体外消化率表明，MD在乳酸菌发酵的作用下蛋白质体外消化率有显著提高，这可能是因为乳酸菌在发酵过程中降解了部分植酸、单宁等抗营养物质。此外，发酵过程中蛋白质发生部分水解使其对蛋白酶更加敏感[9]，且SFMB和SMB蛋白质体外消化率均显著低于SWB，这可能是因为MD中的膳食纤维和脂质、淀粉与蛋白质形成“蛋白质-糖-油”膜结构，进而降低了蛋白质与蛋白酶的接触面积，从而降低了蛋白质的体外消化率[31]。

表4 馒头的总淀粉、蛋白质、膳食纤维含量及体外蛋白消化率Table 4 Total starch,protein and dietary fiber contents and in vitro protein digestibility of steamed bread%

由表5可知，相比于SMB，SFMB的外观、色泽、结构、气味、回弹性、比容等得到了显著提升，口感得分虽有提升但差异不显著。SFMB的感官总评分显著高于SMB，说明乳酸菌发酵使SMB的可接受性更高。

表5 馒头感官评分Table 5 Results of sensory evaluation of steamed bread

3 结论

通过直投式混合乳酸菌发酵剂发酵，有利于改善MD及SMB的品质。在营养品质方面，乳酸菌在发酵面团过程中表现出很强的酸化能力，且酸化稳定期长，有利于MD中乳酸菌代谢产物的积累。同时，乳酸菌发酵能够显著提高MD中RS含量和蛋白质体外消化率，降低OBG和难溶性膳食纤维含量，提高游离氨基酸总含量，优化氨基酸组成模式。此外，乳酸菌发酵能够加强MD中淀粉与蛋白质的相互作用，降解大分子蛋白质和纤维素。在感官评价方面，经过乳酸菌发酵后，馒头感官指数显著提升。本研究结果有助于了解混合乳酸菌发酵剂对MD及SMB所带来的诸多变化，为发酵技术在杂粮制品中工业化应用提供理论基础。