双调蛋白对支气管肺发育不良模型小鼠肺泡分化的影响*

尧惠慈， 卢红艳， 朱 玥， 乔 瑜， 季 玮

（江苏大学附属医院儿科， 江苏 镇江 212001）

支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是一种早产儿慢性肺部疾病，随着围产医学的进步，早产儿存活率提高，BPD的发病率也逐渐升高，其原因主要是发育中未成熟肺的损伤和修复之间的不平衡［1］。肺的发育主要通过上皮细胞和间充质细胞的相互作用介导，肺泡上皮由两种形态与功能不同的细胞组成：Ⅰ型肺泡上皮细胞（type I alveolar epithelial cell， AECI）和Ⅱ型肺泡上皮细胞（type II alveolar epithelial cell， AECII）。平足蛋白（podoplanin， T1α）是AECI的标志物［2］，肺表面活性蛋白C（surfactant protein C， SP-C）是AECII的标志物［3］，在肺上皮损伤正常修复中，AECII增殖并分化为AECI以促进肺泡结构和气血屏障形成，一旦出现分化障碍，肺损伤不可逆［4］。

目前认为BPD主要为肺血管和肺泡生长发育停滞［5］。长期暴露于85%高氧的新生鼠肺泡腔扩大，这表明存在肺发育受阻［6］。表皮生长因子家族成员双调蛋白（amphiregulin， AREG）在上皮细胞和间充质细胞中均表达，能调节不同类型细胞的增殖、凋亡和迁移，包括上皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞［7］。有研究显示，AREG可促进气道上皮细胞和平滑肌细胞的增殖［8］。在呼吸机相关急性肺损伤模型中，肺组织内AREG表达上调，提示AREG表达升高可能参与呼吸机相关肺损伤［9］。在产前烟雾暴露诱导的BPD小鼠模型中，支气管和肺细胞受损可能与AREG-表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor， EGFR）信号转导有关［10］。EGFR是具有多种配体的酪氨酸激酶受体，在上皮细胞中，EGFR的极化及其下游信号的激活在定向细胞迁移中起重要作用［11］。目前，在高氧暴露所致BPD小鼠模型中，AREG对肺泡分化的影响尚不明确，本研究通过建立高氧暴露所致BPD模型小鼠，探讨AREG及EGFR在BPD小鼠肺组织中的动态表达及AREG表达变化对肺泡分化的影响，以期为研究BPD肺泡化障碍机制提供实验依据。

材料和方法

1 主要试剂

小鼠抗AREG多克隆抗体及重组小鼠AREG蛋白（recombinant AREG protein， rmAREG）购自R&D；兔抗EGFR多克隆抗体及小鼠抗β-actin单克隆抗体购自Cell Signaling Technology；兔抗SP-C多克隆抗体、山羊抗兔IgG及驴抗小鼠IgG均购自Abcam；小鼠抗T1α单克隆抗体购自Santa Cruz；HRP标记的山羊抗兔IgG及HRP标记的山羊抗小鼠IgG均购自上海碧云天生物技术有限公司；AREG慢病毒购自上海吉凯基因；PBS购自HyClone。

2 主要方法

2.1 模型制备 SPF级孕16～17 d健康C57BL/6小鼠由江苏大学实验动物中心提供［许可证号：SYXK（苏）2018-0053］。待小鼠出生后，将新生小鼠随机分为空气（normoxia， N）组和高氧（hyperoxia， H）组，利用高氧暴露复制小鼠BPD模型［12］。高氧组小鼠置于氧箱中，氧浓度为85%，空气组置于同一室内常压空气中；代母鼠每12 h在各组间更换一次，以避免氧中毒并排除不同组间代母鼠的影响，每日观察小鼠情况并记录。各组小鼠于空气或高氧暴露后7 d和14 d吸入麻醉处死并分为7 d空气（N7）组、7 d高氧（H7）组、14 d空气（N14）组和14 d高氧（H14）组。取出肺组织，左肺组织用于制作石蜡切片，观察免疫荧光检测，右肺组织冰冻保存用于相关蛋白检测。

2.2AREG过表达及敲低 取重组AREG蛋白5 μg溶于100 μL PBS中，于第10天给高氧暴露新生小鼠腹腔注射重组AREG蛋白（每只100 μL）实现AREG过表达［13］，对照组于相同时间注射相同剂量PBS，并分为rmAREG组和PBS组，每组各5只。取小鼠AREG小干扰RNA（small interfering RNA， siRNA）慢病毒表达载体溶液10 μL（载体浓度为3×1011TU/L），于第10天给高氧暴露新生小鼠鼻内滴注，实现AREG敲低（AREG knockdown， KD）［14］，对照组于相同时间滴注相同剂量阴性对照（negative control， NC）载体溶液，并分为NC组和KD组，每组各5只，各组小鼠于高氧第14天处死并进行后续实验。

2.3 Western blot检测肺组织中AREG、EGFR、SP-C及T1α的蛋白表达 RIPA裂解液（含PMSF、蛋白酶抑制剂）提取各组肺组织总蛋白，按每泳道10 μg总蛋白进行SDS-PAGE分离，湿式电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉溶液37 ℃封闭1 h后，分别加入小鼠抗AREG多克隆抗体（1∶500）、兔抗EGFR多克隆抗体、小鼠抗T1α单克隆抗体、兔抗SP-C多克隆抗体和小鼠抗β-actin单克隆抗体（均1∶1 000），4 ℃孵育过夜。洗膜，分别以HRP标记的山羊抗兔IgG和HRP标记的山羊抗小鼠IgG（均1∶5 000）孵育1 h，ECL化学发光显色。以目的蛋白与内参照β-actin蛋白条带的灰度值的比值表示目的蛋白相对表达水平。

2.4 免疫荧光双标技术检测SP-C/T1α表达 将肺组织切片脱蜡至水，抗原修复后用5% BSA在37 ℃封闭20 min，并与兔多克隆抗SP-C抗体（1∶100稀释）和小鼠单克隆抗T1α抗体（1∶100稀释）的混合物在4 ℃下孵育过夜，切片用PBS洗3次后，与山羊抗兔Ⅱ抗和驴抗小鼠Ⅱ抗（1∶1 000稀释）在37 ℃下避光孵育1 h，PBS洗3次后，采用DAPI室温避光染核，荧光倒置显微镜下观察肺组织的荧光染色，ImageJ软件分析阳性细胞数及共定位。

3 统计学处理

采用SPSS 11.0 统计软件对数据进行统计学分析，采用GraphPad 8.0软件绘制柱状图。计量资料以均数 ± 标准差（mean±SD）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用LSD法，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 高氧暴露BPD小鼠不同时点肺组织中AREG、EGFR、T1α及SP-C的蛋白表达情况

与同时点空气组相比，高氧组AREG、EGFR和T1α蛋白表达升高（P＜0.01），SP-C蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。在空气及高氧状态下，AREG及EGFR蛋白表达随时间呈上升趋势。见图1。

Figure 1. The protein expression of AREG， EGFR， SP-C and T1α in lung tissues of normoxia and hyperoxia mice at different time points. N7： normoxia for 7 d； H7： hyperoxia for 7 d； N14： normoxia for 14 d； H14： hyperoxia for 14 d. Mean±SD. n=5.*P＜0.05， **P＜0.01 vs N7 group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vs N14 group.图1 空气组及高氧组不同时点小鼠肺组织中AREG、EGFR、SP-C及T1α的蛋白表达水平

2 高氧暴露BPD小鼠肺组织中SP-C和T1α免疫荧光共定位情况

采用肺上皮细胞标志物SP-C和T1α蛋白进行免疫荧光染色，绿色荧光为SP-C的阳性表达，红色荧光为T1α的阳性表达，蓝色荧光为DAPI标记的细胞核，SP-C和T1α双阳性则呈橙色。免疫荧光结果显示，相较于同时点空气组，高氧组中SP-C和T1α共定位细胞显著减少（P＜0.05，P＜0.01），见图2。

Figure 2. Immunofluorescence staining of SP-C （green） and T1α （red） in lung tissues of normoxia and hyperoxia mice at different time points （scale bar=20 μm）.Blue indicates DAPI； arrows indicate SP-C and T1α positive cells. N7： normoxia for 7 d； H7： hyperoxia for 7 d； N14： normoxia for 14 d； H14： hyperoxia for 14 d. Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs N7 group；**P＜0.01 vs N14 group.图2 空气组及高氧组不同时点小鼠肺组织SP-C和T1α免疫荧光共定位情况

3 高氧暴露BPD小鼠过表达AREG后肺组织中AREG、EGFR、T1α及SP-C的蛋白表达情况

在高氧状态下，腹腔注射rmAREG后，与PBS组相比，rmAREG组中AREG和EGFR蛋白表达显著升高 （P＜0.01），而SP-C和T1α蛋白表达显著降低（P＜0.01），见图3。

4 高氧暴露BPD小鼠过表达AREG后肺组织中SP-C和T1α免疫荧光共定位情况

在高氧状态下，注射rmAREG后，rmAREG组中SP-C与T1α共定位细胞较PBS组显著减少（P＜0.01），见图4。

5 高氧暴露BPD小鼠敲低AREG后肺组织中AREG、EGFR、T1α及SP-C的表达情况

在高氧状态下，小鼠鼻内滴注AREG siRNA慢病毒表达载体溶液后，与NC组比较，KD组中AREG和EGFR蛋白表达显著降低 （P＜0.01），而SP-C和T1α蛋白表达则显著升高（P＜0.01），见图5。

Figure 3. The protein expression of AREG， EGFR， SP-C and T1α in mice lung tissues after overexpression of AREG under hyperoxia. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs PBS group.图3 高氧下过表达AREG后小鼠肺组织AREG、EGFR、SP-C及T1α的蛋白表达水平

6 高氧暴露BPD小鼠敲低AREG后肺组织中SP-C和T1α免疫荧光共定位情况

在高氧状态下，小鼠鼻内滴注AREG siRNA慢病毒表达载体溶液后，与NC组相比，KD组中SP-C与T1α共定位细胞显著增多（P＜0.01），见图6。

讨 论

BPD是早产儿最常见的并发症之一，其主要病理学特征是肺泡化受阻，表现为AECII向AECI分化障碍［10］。AREG在免疫调节中有重要作用，是参与炎症细胞中肌成纤维细胞分化的驱动因素［15］。本研究通过建立高氧暴露的BPD模型小鼠，过表达及敲低AREG并观察其对肺泡分化的影响，结果显示AREG抑制高氧暴露的BPD模型小鼠AECII向AECI分化。

Figure 4. Immunofluorescence staining of SP-C （green） and T1α （red） in mice lung tissues after overexpression of AREG under hyperoxia（scale bar=20 μm）. Blue indicates DAPI； arrows indicate SP-C and T1α positive cells. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs PBS group.图4 高氧下过表达AREG后小鼠肺组织中SP-C和T1α免疫荧光共定位细胞情况

肺发育是一个复杂的过程，可分为胚胎期、假腺体期、小管期、囊泡期和肺泡期［16］。在小管期和囊泡期阶段，肺细胞开始分化，末端分支变窄并形成上皮囊，在出生后肺泡阶段发育成肺泡［17］。BPD的主要病理变化发生在囊泡期和肺泡期，肺发育中断，肺泡化过程受阻［18-19］。本研究通过对高氧暴露BPD模型小鼠肺上皮标志物研究，观察到与同时点空气组相比，高氧组SP-C蛋白表达降低，T1α蛋白表达增加，提示高氧后AECII减少而AECI增加，但免疫荧光双标显示SP-C与T1α共定位细胞并未增加，反而减少，提示高氧下AECII向AECI分化减少。由于实验条件所限，本研究未能对AECII进行示踪研究，但有研究通过对AECII进行特殊标记，观察到在高氧状态下，T1α的增多并不是由已标记的AECII分化而来［20］，且有研究显示，在高氧状态下，尽管T1α蛋白表达增加，但在损伤修复时AECI功能受损，这可能与肺上皮紧密连接破坏以及气血屏障受损有关［21］，结合本次研究结果，提示在高氧状态下存在AECII向AECI分化障碍。

Figure 5. The protein expression of AREG， EGFR， SP-C and T1α in mice lung tissues after knockdown of AREG under hyperoxia. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs NC group.图5 高氧下敲低AREG后小鼠肺组织中AREG、EGFR、SPC及T1α的蛋白表达水平

AREG在上皮细胞生长和分化中作用的研究引起关注。Hillman等［22］研究显示，在早产羔羊机械通气期间，肺组织AREG表达随着机械通气时间增多而升高，并影响肺泡分化。本研究观察到高氧组中AREG表达较同时点空气组升高，提示AREG参与了BPD的病理生理过程。Zuo等［23］研究显示，AREG可驱动气道上皮细胞向基质细胞和黏膜细胞增生分化，但AREG是否参与BPD肺泡分化障碍尚不明确。

Figure 6. Immunofluorescence staining of SP-C （green） and T1α （red） in mice lung tissues after knockdown of AREG under hyperoxia（scale bar=20 μm）. Blue indicates DAPI； arrows indicate SP-C and T1α positive cells. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs NC group.图6 高氧下敲低AREG后小鼠肺组织SP-C和T1α的免疫荧光共定位情况

为进一步探讨AREG表达变化对高氧暴露BPD模型小鼠肺泡分化的影响，本研究通过腹腔注射rmAREG蛋白实现AREG过表达，鼻内滴注AREG siRNA慢病毒表达载体溶液实验AREG敲低，并检测肺组织中SP-C和T1α表达变化，观察到过表达AREG后，SP-C蛋白及T1α蛋白表达减少，SP-C与T1α共定位细胞数显著减少，表明BPD小鼠过表达AREG后AECII向AECI分化障碍加重。在肺慢性异体移植功能障碍的气道重塑中，观察到AREG主要定位于气道上皮细胞，且过表达AREG后，出现纤毛细胞分化，纤维化增加［24］。而在西地那非治疗的BPD模型大鼠中，AREG mRNA的表达降低，肺泡化障碍得以改善［25］。本研究显示，敲低AREG后，SP-C和T1α蛋白表达增加，SP-C与T1α共定位细胞增多，也进一步证实AREG减少可缓解高氧暴露BPD小鼠中AECII向AECI分化障碍。在转化生长因子β诱导的肺纤维化发病机制中，AREG的沉默会降低成纤维细胞的增殖、肌成纤细胞的转化及胶原沉积［26］，在萘诱导的肺损伤模型中也显示AREG是肺上皮黏液细胞化生的关键因子，AREG敲除后肺上皮黏液细胞化生得到缓解［27］，这与本研究一致，提示AREG可通过影响AECII向AECI分化参与BPD的发展。在病理状态下，肺上皮细胞可通过上皮-间质转化为基质成纤维细胞或肌成纤维细胞，导致BPD的异常修复［28］，但AREG是否参与BPD上皮-间质转化仍有待进一步研究。

Lkhagvadorj等［10］研究表明，AREG/EGFR信号通路与受损的上皮细胞分化有关，作为AREG的受体，EGFR可调节肺损伤后细胞的生长、分化、迁移以及细胞间黏附［29］。本研究显示高氧组EGFR表达升高，且随着高氧时间的延长，EGFR表达呈上升趋势，提示在高氧状态下，EGFR增多以响应AREG/EGFR信号转导。本实验进一步研究观察到过表达AREG后，EGFR蛋白表达升高，而敲低AREG后，EGFR蛋白表达降低，提示EGFR表达趋势与AREG一致。Todd等［24］研究显示，在肺移植后的气道重塑中，AREG和EGFR转录组在组织中大量表达，且定位于富有纤维组织的气道上皮细胞，也有研究观察到脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的BPD大鼠模型中，EGFR的增加影响了肺肌成纤维细胞的定位，导致BPD中肺泡发育受阻［30］。综合以上研究，推测AECII向AECI分化障碍与AREG/EGFR信号通路有关，该机制可能在BPD模型小鼠肺泡分化障碍机制中起重要作用，但仍需进一步研究。

综上所述，本研究初步探讨了AREG对BPD模型小鼠肺泡分化的影响，观察到高氧暴露BPD模型小鼠肺组织AREG升高，AECII向AECI分化障碍；高氧下敲低AREG后，AECII向AECI分化障碍缓解，提示AREG参与了BPD模型小鼠肺泡分化障碍的病理生理过程，可能与AREG抑制AECII向AECI分化有关。本研究的局限性在于未能结合AECII示踪技术探讨肺上皮细胞分化，且仅通过腹腔注射外源性重组AREG蛋白及AREG慢病毒实现AREG过表达及敲低，未能通过基因敲除技术敲除小鼠AREG进行研究，这些将在今后的研究中进一步优化。