E2F调控lncRNA HOTAIR在高磷诱导VSMCs钙化中的作用机制研究*

陈艳霞， 柯 本， 涂卫平， 陈 艳， 黄 翀， 朱淑英

（南昌大学第二附属医院肾脏内科，江西 南昌 330006）

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是威胁人类健康的主要疾病之一，其患病率超过10%［1］，其中矿物质代谢紊乱导致的血管钙化（vascular calcification， VC）是其特有且常见的并发症或合并症。CKD患者死亡的主要原因为心血管疾病（cardio vascular diseases， CVD），发生比例为 61.5%［2］，其死亡率增加的独立危险因素为VC，同时VC被认为是最高的心血管危险因素［3］。据报道，CKD5期患者VC的发生率高达80%～90%［4］。许多因素参与了VC的发病机制［5］，CKD患者的高磷血症已被证实是VC发病率和死亡率的独立危险因素［6］。VC是一个被积极调节的病理生理过程［7］，且关键环节是血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells， VSMCs）向成骨细胞的转化［8］。前期研究显示高磷（high phosphorus，HP）能够诱导VSMCs的钙化，促使其向成骨细胞的表型发生转化，表达骨分化的标志物如骨形态发生蛋白9、Runt相关转录因子2等，同时其收缩表型如α-平滑肌肌动蛋白的表达下调［9］。深入探讨CKD患者VC的病理发生发展过程，对防治CKD患者的CVD，改善预后降低心血管风险具有重要研究意义和临床价值。

长链非编码RNA（long noncoding RNA， lncRNA）HOTAIR可通过靶向miRNA-130b-3p抑制VSMCs的凋亡［10］，参与VC过程。我们前期研究发现lncRNA HOTAIR可通过靶向miR-126上调Klotho从而抑制Wnt/β-catenin信号通路逆转HP诱导的VSMCs钙化［11］。生物信息学发现lncRNA HOTAIR的上游转录因子为 E2F、E2F-1、E2F-2、E2F-3a、E2F-4和叉头框蛋白 O1a（forkhead box protein O1a， FOXO1a），且已有研究表明E2F可通过调控细胞凋亡、炎症并介导Wnt/β-catenin信号通路发挥生物学作用，下调VC相关的骨桥蛋白的表达［12-14］，提示E2F在VC发挥重要作用，但具体机制不清楚。本研究拟探讨E2F调控lncRNA HOTAIR在HP诱导VSMCs钙化中的作用及其机制，为VC防治寻找新的干预靶点和治疗策略提供研究方向。

材料和方法

1 主要试剂与仪器

人VSMCs购自于Lonza；钙沉积含量测定试剂盒购自于Biovision；细胞培养液中的胎牛血清购自Gibco；DMEM/F12 培养液购自 HyClone；Trizol试剂、qPCR用试剂盒、BCA试剂盒、Lipofectamine 2000、双萤光素酶相关的试剂、抗体、引物等均购自Invitrogen。核酸蛋白测定仪、PCR扩增仪和凝胶图像成像系统购自Bio-Rad；DYPC-31DN型电泳仪为北京六一仪器厂产品；酶标仪为Thermo产品。

2 实验方法

2.1 HP诱导VSMCs钙化构建细胞钙化模型和实验分组 以人主动脉VSMCs为研究对象，采用HP［10 mmol/L β-磷酸甘油酯（β-glycerol phosphate， β-GP）］诱导12 d后构建细胞钙化模型［9］。实验分组如下：正常对照（control）组，正常VSMCs培养；HP组，正常VSMCs+10 mmol/L β-GP共培养；HP+空载（HP+Adlaz）组，正常VSMCs+10 mmol/L β-GP共培养+Adlaz；HP+过表达 E2F（HP+AdE2F）组，正常 VSMCs+10 mmol/L β-GP共培养+AdE2F。以上实验处理中，转染时间为48 h。

2.2 RT-qPCR Trizol法提取组织或细胞RNA，逆转录合成cDNA。采用Primer Premier5.0设计上游和下游引物，将所得cDNA加至PCR反应体系中扩增目标片段。PCR反应条件为：95 ℃ 15 min；94 ℃变性30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 40个循环，以GAPDH作为参考。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

2.3 Western blot 首先采用RIPA裂解液裂解细胞收集蛋白并进行蛋白浓度的测定，其次SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白电泳后湿转于PVDF膜上，采用含5%脱脂奶粉的TBST封闭液封闭2 h，加入Ⅰ抗孵育过夜后加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗，洗膜后加入化学发光试剂显色。凝胶成像分析仪摄像并计算出检测蛋白灰度值。

2.4 茜素红S染色 PBS漂洗3次，10%中性甲醛固定，室温环境下孵育10 min，双蒸水漂洗3遍；加茜素红S染色液滴染1～5 min；McGee-Russell分化液进行迅速分化数秒，Mayer苏木素染色核浅染1～2 min后冲洗10 min；使用中性树胶封固后于倒置显微镜下观察，读取562 nm处的吸光度（absorbance，A）进行定量。

2.5 钙沉积含量测定 按说明书操作步骤准备标准曲线，准备好样品按操作说明书进行具体操作，30 min内读取波长610 nm处的标准液及待测样品的A值，根据标准曲线计算待测样品中钙含量。

2.6 双萤光素酶报告基因实验 采用生物信息学软件进行预测E2F、lncRNA HOTAIR和Klotho的可结合区域，合成E2F、Klotho野生（wild-type， WT）和突变（numtant， MUT）报告质粒，分别为E2F-WT-luc、E2F-MUT-luc、Klotho-WT-luc和 Klotho-MUT-luc。当VSMCs培养达到70%～80%融合时，通过Lipofectamine 2000将合成的报告质粒与lncRNA HOTAIR模拟物（mimics）或lncRNA HOTAIR阴性对照（negative control， NC）共转染48 h，根据制造商的方案，通过双萤光素酶报告基因系统评估每组萤光素酶相对活性，验证E2F、lncRNA HOTAIR和Klotho的关系。

3 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理。计量资料数据符合正态分布的用均数±标准差（mean±SD）表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组奖比较采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 E2F、lncRNA HOTAIR和Klotho在HP诱导的VSMCs钙化中的表达

采用HP诱导VSMCs钙化构建细胞钙化模型，结果表明，HP组VSMCs出现钙化，钙沉积含量增加（图1A）； RT-qPCR显示E2F mRNA、lncRNA HOTAIR和Klotho mRNA在HP组VSMCs中表达下调（图1B）；Western blot显示E2F和Klotho蛋白在HP组VSMCs中表达下调（图1C）。

Figure 1. Expression of E2F， lncRNA HOTAIR and Klotho in calcification of VSMCs induced by high phosphorus （HP）. A： calcium deposit content； B： the expression of E2F mRNA， lncRNA HOTAIR and Klotho mRNA detected by RT-qPCR； C：the expression of E2F and Klotho proteins detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group.图1 E2F、lncRNA HOTAIR和Klotho在高磷诱导的VSMCs钙化中的表达

2 过表达E2F对HP诱导VSMCs钙化的影响

茜素红染色及钙沉积测定结果显示，过表达E2F后VSMCs钙化程度减轻（图2A、C）； RT-qPCR结果显示，HP+AdE2F组VSMCs中lncRNA HOTAIR和Klotho mRNA表达上调（图2B）；Western blot结果显示，HP+AdE2F组VSMCs中E2F和Klotho蛋白表达上调（图2D）。

Figure 2. Effect of E2F overexpression on high phosphorus （HP）-induced VSMCs. A： alizarin red S staining showed the formation of intracellular calcium nodules； B： the expression of E2F mRNA， lncRNA HOTAIR and Klotho mRNA detected by RT-qPCR； C： calcium deposit content； D： the protein levels of E2F and Klotho detected by Western blot. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vs HP+Adlaz group.图2 过表达E2F对高磷诱导VSMCs的影响

3 E2F与lncRNA HOTAIR靶向关系验证

生物信息学发现lncRNA HOTAIR的上游转录因子为E2F，通过GSEA发现lncRNA HOTAIR高表达与KEGG通路中基础转录因子通路（BASAL_TRANSCRIPTION_FACTORS）显著正相关（NES=1.488，P=0.047），提示lncRNA HOTAIR上游可能受到转录因子的调控。Jaspar生物信息学网站预测发现转录因子E2F与lncRNA HOTAIR启动子存在5个结合位点。萤光素酶活性分析示lncRNA HOTAIR的低表达显著降低E2F WT中的萤光素酶活性，E2F的表达水平与lncRNA HOTAIR有直接相关性，呈现明显的正相关，见图3。

4 Klotho是lncRNA HOTAIR的靶基因

生物学信息软件预测发现，lncRNA HOTAIR的1 967～1 859位置与Klotho的976～1 117位置存在碱基互作配对，预测结合能为-30.3772 kcal/mol，提示lncRNA HOTAIR与Klotho具有可结合区域（图4A）；萤光素酶活性分析示lncRNA HOTAIR的低表达显著降低Klotho WT中的萤光素酶活性，Klotho的表达水平与lncRNA HOTAIR有直接相关性，呈现明显的正相关（图4B）。

讨 论

lncRNA为大于200个核苷酸的非编码RNA，可直接调控基因的表达，也可通过“分子海绵”作用靶向多个 miRNA，间接调控基因的表达［15］。lncRNA HOTAIR的基因定位于12号染色体，为转录自HOXC位点的反义链［16］。在人主动脉瓣膜细胞中，lncRNA HOTAIR可被循环拉伸及受Wnt/β-catenin调节抑制细胞钙化［17］。lncRNA HOTAIR抑制大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，其作用机制与调控Wnt/β-catenin途径有关［11］。lncRNA HOTAIR可通过靶向miRNA-130b-3p抑制VSMCs的凋亡［10］，参与VC钙化的过程。同时我们发现在HP诱导VSMCs钙化的细胞模型中，lncRNA HOTAIR可通过靶向miR-126上调Klotho抑制Wnt/β-catenin信号通路逆转HP诱导的VSMCs钙化［18］。由此可见，lncRNA HOTAIR参与CKD患者的VC过程。

Figure 4. Klotho was the target gene of lncRNA HOTAIR. A：binding regions between lncRNA HOTAIR and Klotho； B： low expression of lncRNA HOTAIR significantly reduced the luciferase activity in Klotho-WT. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs sh-NC group.图4 Klotho是lncRNA HOTAIR的靶基因

转录因子E2F最初是由于发现其能激活腺病毒E2启动子而被命名的，目前发现哺乳动物存在着多种E2F蛋白，每种E2F蛋白由300～500个氨基酸组成，且在结构上形成其特有稳定的结构域，为其发挥复杂功能的结构基础。E2F家族包括E2F1～8，通过介导特定下游靶基因转录激活调节细胞增殖和细胞周期。E2F家族还具有调节自噬、线粒体功能和DNA损伤反应的作用［19］。生物信息学发现，lncRNA HOTAIR的上游转录因子为E2F、E2F-1、E2F-2、E2F-3a、E2F-4和FOXO1a，且已有研究表明E2F可通过调控细胞凋亡和炎症并介导Wnt/β-catenin信号通路发挥生物学作用，下调VC相关的骨桥蛋白的表达［12-14］，提示E2F在VC中发挥重要作用，但具体机制不清楚。我们研究发现HP诱导的VSMCs钙化中，HP组E2F和lncRNA HOTAIR表达下调，E2F蛋白也表达下调，提示E2F参与HP诱导的VSMCs钙化。过表达E2F，HP诱导的VSMCs钙化减轻，lncRNA HOTAIR表达逆转，提示E2F对HP诱导的VSMCs钙化具有保护作用，同时本研究发现lncRNA HOTAIR是E2F的靶基因，且具有正相关。因此，我们推测E2F通过调控lncRNA HOTAIR表达参与HP诱导VSMCs钙化过程。

Klotho介导VC的调控机制复杂。研究发现，LRRC75A-AS1可通过抑制VSMCs成骨样表型转化改善 VC［20］。lncRNAH19 通过 MAPK 信号通路调控Runt相关转录因子2的表达诱导VSMCs成骨样表型转化促进VC［21］。lncRNAES3可介导高糖诱导的VSMCs钙化［22］。虽对lncRNA的研究在不断增加，但lncRNA调控VC的研究较少［23］。我们既往研究提示lncRNA-SNHG29可通过下调miR-200b-3p激活Klotho/FGF23轴抑制 HP 诱导的 VSMCs的钙化［24］，Klotho可通过抑制Wnt7b/β-catenin信号通路逆转HP诱导的VC过程［8］。本研究发现在HP诱导的VSMCs钙化中，HP组E2F和Klotho mRNA表达下调，Klotho蛋白也表达下调。过表达E2F后，Klotho mRNA表达呈现逆转，结合本项目组既往研究结果，推测E2F通过调控lncRNA HOTAIR介导Klotho参与HP诱导VSMCs钙化过程。

本实验目前局限在细胞水平的研究，动物水平及临床水平E2F通过调控lncRNA HOTAIR介导Klotho参与HP诱导VSMCs钙化过程需要进一步探讨。本研究提示E2F通过调控lncRNA HOTAIR介导Klotho参与HP诱导VSMCs钙化过程，为CKD患者VC的防治提供新的思路和依据。