不同环保固定试剂在胸水细胞蜡块中的应用

赵栋梁,脱 颖,康继辉

优质的胸腔积液细胞蜡块不但可以确诊疾病,还可以为临床靶向治疗提供可靠的材料进行蛋白和基因检测,目前已被广泛应用于胸水脱落细胞学检查[1-2]。良好的脱落细胞固定是获得高质量细胞蜡块的前提,直接影响后续一系列检测和病理诊断。常规脱落细胞固定试剂主要为乙醇甲醛混合剂或乙醇乙醚混合剂等,这些细胞固定剂中含有的醛类和乙醚等物质均对人体有巨大伤害。为保护环境、避免病理职业性危害,本研究将三种国产环保固定试剂与常规细胞固定试剂处理脱落细胞得到的细胞蜡块质量及染色效果进行对比,探求制作细胞蜡块最有效的绿色环保固定试剂。

1 材料与方法

1.1 材料选取2023年1月中山大学附属第一医院病理科细胞室接收的胸腔积液20例。三种环保固定试剂分别购自德仁科教仪器设备公司、深圳子科公司、九州柏林生物公司。德仁科教仪器设备公司环保固定试剂主要成分为:栀子花提取物;深圳子科公司环保固定试剂主要成分为:植物多糖和聚乙烯醇;九州柏林生物公司环保固定试剂主要成分为:聚乙二醇、无水甲醇。常规细胞固定试剂:10%中性福尔马林缓冲液和95%乙醇等比例混合。免疫组化试剂均购自Leica公司。

1.2 方法将临床送检的胸腔积液于4 ℃静止4 h,弃去适量上清液,剩余上清液和沉淀物震动混匀,分别取10 mL混悬液4份,分为Ⅰ组(九州柏林生物公司)、Ⅱ组(德仁科教仪器设备公司)、Ⅲ组(深圳子科公司)、Ⅳ组(常规固定组)。2 000 r/min离心10 min,重悬至上述四组固定液,每组5 mL,再次2 000 r/min离心10 min(各组固定时间等同离心时间均为10 min),弃上清,倒置离心管于滤纸上去除残留液体,分别加入2%琼脂,室温下凝固并常规脱水包埋制成细胞蜡块,进行细胞蜡块HE染色,根据细胞形态及细胞的异型性进行免疫组化染色。染色结果由细胞室高年资病理医师按照《中国浆膜腔积液细胞病理学检查专家共识(2020版)》[3]进行评估和判读,并根据是否有利于诊断,按优秀、良好、一般三个等级依次计3分、2分、1分。

1.3 统计学分析利用GraphPad软件对数据进行统计学分析,采用One-Way ANOVA检验分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 富集细胞量四组胸水标本经固定离心后,相同体积的胸水标本经不同固定液处理,富集的细胞量Ⅰ组和Ⅲ组明显多于Ⅱ组和Ⅳ组(图1)。

图1 不同固定试剂处理获得的细胞沉渣比较:A.Ⅰ组;B.Ⅱ组;C.Ⅲ组;D.Ⅳ组

2.2 染色及判读四组细胞蜡块HE染色均核质分明,染色背景干净。其中,Ⅰ组更具组织标本的形态,可见更多异型性细胞,相反Ⅱ组效果较差,富集细胞少,且胞质染色较淡,出现细胞核固缩现象(图2)。免疫组化染色显示:CK7、PAX8、MC免疫组化染色结果一致,同一病例Ⅰ组和Ⅳ组的标记及染色效果好且定位清晰,但Ⅱ组部分指标出现淡染现象(图2)。四组标本的病理判读一致。

图2 四组细胞蜡块HE染色和免疫组化染色效果比较

2.3 判读评分Ⅰ组的评分高于Ⅳ组,差异有统计学意义(P<0.05);Ⅱ组的评分低于Ⅳ组,差异有统计学意义(P<0.05);Ⅲ组的评分稍低于Ⅳ组,但差异无统计学意义(P>0.05,图3)。

图3 四组细胞蜡块判读得分比较

3 讨论

恶性肿瘤细胞比正常细胞更易从原位脱落,因此对脱落细胞的检查是一项对患者创伤小且经济方便的方法,对临床肿瘤的诊断十分有效[4],使用各种方法取得脱落肿瘤细胞或组织颗粒便可鉴定其性质。常规涂片法简洁、快速,但由于细胞量较少、涂片时细胞易变形,涂片厚薄不均导致癌细胞形态不典型、背景杂质较多,并具有不能反复切片、重复使用等缺点,给诊断带来困扰。一个制作优良的细胞蜡块能最大限度地保留癌细胞,减少细胞丢失,降低漏诊率并可用于后续的免疫组化染色和原位杂交检测,能弥补细胞液基检测和涂片的局限,帮助明确诊断、提供疾病治疗方案的辅助指标及对患者的预后评估提供参考[5-7]。而制作高质量的细胞蜡块,固定液的选择是关键,良好的固定能保持组织细胞及细胞内物质尽可能接近其存活时状态。

目前科室细胞室常规使用的细胞固定液为福尔马林-乙醇混合剂,其经济实惠,适用于大多病理细胞室脱落细胞的细胞蜡块制作[8],该方法制备的细胞蜡块HE染色鲜明,具有组织的细胞形态,免疫组化标记定位明确、标记清晰,便于诊断。但是该固定液中使用的甲醛有刺激性气味,腐蚀性强,其蒸气对呼吸道黏膜和眼睛有强烈的刺激[9]。此外,常规固定剂应用于细胞学的富集效果不尽人意,尤其是细胞量偏少的细胞标本导致石蜡制成率进一步降低。因此,亟需寻求可富集更多细胞且健康环保的替代试剂,以解决长期以来甲醛、苯类、乙醚等危害病理工作者身体健康的难题。目前国内也涌现了一批环保试剂,但效果如何还需进一步确认。本文探索了市场上较为主流的三种环保固定试剂,拟寻找制备过程更安全且优良高效的细胞蜡块替代固定试剂。

本研究使用的三组环保试剂不含醛、苯等有害物质,成分均无毒无害。本研究结果显示,四个组别虽有一定差异,但均取得了不错的制备和染色效果,其中Ⅰ组使用的环保固定试剂效果最佳,不仅HE染色和免疫组化抗原标记优异,利于后续其他辅助检测的开展,且能富集更多的细胞,综合评估更利于诊断。此外,环保试剂可避免病理职业性危害,具有替代传统试剂的潜力。虽然接收环保试剂需要一定过程,但使用更加绿色安全环保的替代品是大势所趋,值得摸索适应和推广。