补阳还五汤调节铁代谢蛋白改善脑缺血神经元损伤的研究

梁 祺，吴海辉，王珊珊，杨 彤，葛金文，2*

1.湖南中医药大学中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208；

2.湖南省中医药研究院，湖南 长沙 410006

脑缺血是指由于各种原因引起脑血管堵塞导致组织缺血缺氧坏死，出现偏瘫、意识障碍等以神经功能损伤为主的疾病。 脑缺血是一个持续数小时甚至数天的空间以及时间变化的事件，发病机制复杂，自由基损伤、钙超载等许多病理生理过程参与了病程进展[1]。 铁是机体必需的微量元素，参与了氧的转运与利用和髓鞘蛋白合成等过程，与脑发育和代谢等生理过程密切相关[2]。 研究表明，在脑缺血后出现显著脑铁代谢紊乱，铁沉积会导致神经元损伤加重[3]。补阳还五汤是益气活血法的代表方，是中医临床治疗脑缺血的经典方剂。许多研究证明，补阳还五汤对脑缺血的治疗效果显著，能够降低脑缺血后铁沉积[4-6]。本研究通过细胞实验模拟半体内环境，以补阳还五汤为干预药物，探讨补阳还五汤调控脑缺血后铁稳态失衡，改善神经元损伤的作用机制。

1 材料

1.1 动物来源

18 只SPF 级SD 雄性大鼠，体质量200～220 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司[许可证号：SCXK（湘）2019-0004，质量合格证号：430727201101237013]。饲养于湖南中医药大学实验动物中心[使用许可证编号：SYXK（湘）2019-0009]。 环境温度（24.0±0.5） ℃，相对湿度50%～60%，自由摄食，昼夜光照，适应性饲养3 d。 本研究经湖南中医药大学实验动物中心伦理委员会审查批准（伦理编号：LL201907230006）。

1.2 细胞来源

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC12 细胞株，购自中国科学院上海细胞库，货号：TCR9。

1.3 药物制备

补阳还五汤药物组成：生黄芪120 g，当归6 g，赤芍5 g，川芎3 g，地龙3 g，红花3 g，桃仁3 g（批号分别为2102003C、2102004C、2107008C、2109015C、2102001C、2103003C、2109002S）。 中药均购自湖南中医药大学第一附属医院，经湖南中医药大学刘林副教授鉴定，符合2015 年版《中国药典中药材及饮片彩色图鉴》规定[7]。 取标准中药饮片加蒸馏水6～8 倍量，分煎2 次后混匀合并，滤过，浓缩至含生药2 g/mL，4 ℃储存备用。去铁酮片（批号H20140379），购自加拿大奥贝泰克制药有限公司，临用现配。

1.4 主要试剂与仪器

PBS 缓冲液（批号：PB120327，武汉普诺赛生命科技有限公司）；DMEM 高糖培养基（批号：PM150210,武汉普诺赛生命科技有限公司）；DMEM 无糖培养基（批号：PM150270, 武汉普诺赛生命科技有限公司）；胰蛋白酶（批号：PB180226，武汉普诺赛生命科技有限公司）；青链霉素（批号：PB180120，武汉普诺赛生命科技有限公司）；CCK-8 试剂盒（批号：ECK-A362，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；BCA 试剂盒（批号：E-BC-K318-M，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；活性氧（reactive oxygen species, ROS）测定试剂盒（批号：E004-1-1，南京建成生物工程研究所）；超氧化物歧化酶活力（superoxide dismutase, SOD）测定试剂盒（批号：A001-3-2，南京建成生物工程研究所）；丙二醛（malondialdehyde, MDA）测定试剂盒（批号：A003-1-2，南京建成生物工程研究所）；转铁蛋白受体（transferrin receptor,TFR）多克隆抗体（批号：A5865，武汉爱博泰克生物科技有限公司）；铁调素（hepcidin, HEP）多克隆抗体（批号：ab30760，Abcam 公司）；膜铁转运蛋白（ferroportin, FPN）多克隆抗体（批号：ab58695，Abcam 公司）；GAPDH 抗体（批号：10494-1-AP，武汉三鹰生物技术有限公司）；山羊抗小鼠（批号：EAB-1001，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；山羊抗兔（批号：E-AB-1003，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；甲醇（批号：10014118，国药集团化学试剂有限公司）；Tween-20（批号：#T8220，北京索莱宝科技有限公司）；ECL 化学发光底物（批号：170-5，伯乐生命医学产品(上海)有限公司）；CO2培养箱（型号：3131，赛默飞世尔科技公司）；全自动化学发光成像分析系统（型号：Tanon5200，上海天能公司）。

2 方法

2.1 动物处理

18 只SD 雄性大鼠随机分为6 组，分别予以极低、低、中、高剂量补阳还五汤药液、铁离子螯合剂去铁酮片和等量的生理盐水灌胃，1 mL/100 g，1 次/d。补阳还五汤中剂量为25.8 g/kg（按60 kg 成年人每日剂量生药为依据，大鼠剂量按体表面积换算，相当人临床等效剂量的2 倍）。 极低、低、中、高剂量浓度比为0.5∶1∶2∶4。 连续灌胃7 d 后，末次给药1 h 后腹主动脉采血，3.8%枸橼酸钠抗凝（1∶9），4 ℃、3000 r/min（离心半径r=15.9 cm） 离心15 min 取上清液，0.22 μm孔筛过滤灭菌后置于-80 ℃留存备用。 各给药组各鼠血浆等量混合即为含药血浆， 空白组各鼠血浆等量混合即为空白血浆。

2.2 细胞OGD 模型建立

按照GOLDBERG 等[8]的方法进行改良处理，细胞培养液换为预先通以缺氧混合气（94% N2+5%CO2+1% O2）30 min 的无糖培养液，随后将细胞立即置于缺氧密闭室内，继续通予缺氧混合气，于37 ℃饱和湿度条件下培养。 OGD 损伤6 h 后进行药物干预[9-10]。

2.3 实验分组及给药

2.3.1 筛选补阳还五汤最佳给药浓度 细胞正常培养后分为正常组、模型组、空白血浆组、补阳还五汤含药血浆组（极低、低、中、高剂量组），共7 组。 采用三气培养箱进行氧糖剥夺（oxygen-glucose depriva tion, OGD）造模。根据罗银河和陈刚等[11-12]实验结果选择10%含药血浆进行实验，各组细胞造模后分别给予等体积相应10%含药血浆的培养基干预。 继续培养24 h 后进行细胞活力检测，同时显微镜下观测细胞生长形态。

2.3.2 药物干预各组细胞 确定补阳还五汤最佳给药浓度后，细胞分为正常组、模型组、补阳还五汤最佳含药血浆组（低剂量组）、去铁酮组，共4 组。 采用三气培养箱进行OGD 造模。正常组和模型组使用含有10%空白血浆的基础培养基培养，补阳还五汤最佳含药血浆组和去铁酮组分别使用含10%各自药物的基础培养基处理。药物干预24 h 后进行各项指标检测。

2.4 指标检测

2.4.1 CCK-8 法检测细胞活性 细胞接种于96 孔板，除正常组外，其余各组完成OGD 造模并进行含药血浆干预后，向每个孔中加入CCK-8 溶液10 μL，转移培养板到培养箱中孵育1 h，然后在酶标仪450 nm 处测量各组OD 值并进行计算。

2.4.2 检测ROS 含量 将DCFH-DA 按照1∶1000用无血清培养液稀释，终浓度为10 μmol /L。 细胞经过OGD 造模后去除原有培养液，每个皿加入不少于1 mL 稀释后的DCFH-DA，充分盖住细胞。 37 ℃下孵育20 min。 再用无血清培养液轻洗细胞3 次，去除多余的DCFH-DA。 在荧光分光光度计下调整激发波长488 nm，发射波长525 nm 进行检测。

2.4.3 检测SOD 活力 细胞经OGD 造模并进行含药血浆培养基干预，消化吹打后将细胞悬液转入离心管，1000 r/min（离心半径r=15.9 cm）离心10 min，弃上清，冰上裂解沉淀细胞20 min，充分裂解后将样品12 000 r/min（离心半径r=8.6 cm）离心10 min，取上清，按试剂盒说明书配制工作液进行SOD 检测，同时用BCA 试剂盒测定蛋白浓度，按公式计算SOD 活力。

2.4.4 检测MDA 含量 细胞经OGD 造模并进行含药血浆培养基干预，消化吹打后将细胞悬液转入离心管，1000 r/min（离心半径r=15.9 cm）离心10 min，弃上清，冰上裂解沉淀细胞20 min，充分裂解后将样品12 000 r/min（离心半径r=8.6 cm）离心10 min，取上清，按试剂盒说明书配制工作液进行MDA 检测，同时用BCA 试剂盒测定蛋白浓度，按公式计算MDA 含量。

2.4.5 Western blot 检测TFR、HEP、FPN 蛋白的表达水平 细胞经OGD 造模并进行含药血浆培养基干预，洗涤后加入RIPA 裂解液和蛋白酶抑制剂，裂解后离心，取上清液并采用BCA 测量蛋白浓度，制备SDS 上样液，-80 ℃保存。制备10%分离胶和5%浓缩胶，上样后进行蛋白电泳，转膜1.5 h 后脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST 稀释一抗 （Hepcidin 稀释比为1∶500，TFR 稀 释比 为1∶1000，FPN 稀 释 比 为1∶500，GAPDH 稀释比为1∶5000），4 ℃孵育，过夜。 次日洗膜，滴加相应二抗（山羊抗兔1∶8000、山羊抗小鼠1∶8000）后37 ℃孵育1 h，最后显色并进行分析。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 筛选补阳还五汤含药血浆最佳给药浓度

与正常组比较，模型组细胞存活力出现显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，空白血浆组的细胞活力无统计学差异，而补阳还五汤各剂量含药血浆组的细胞活力均出现明显升高（P＜0.05）；与低剂量组比较，中剂量、高剂量含药血浆组的细胞活力出现明显下降（P＜0.01），极低剂量组细胞活力有下降趋势，无统计学差异。 详见图1。

图1 补阳还五汤含药血浆浓度梯度的细胞活性比较

3.2 不同药物对细胞活力的影响

显微镜观察各组间细胞形态改变的结构如图2所示，正常组细胞形态规整，呈两级或多级，胞体大而明显，树突相互缠绕。与正常组比较，模型组细胞出现显著损伤，细胞数目明显减少，形态凌乱，树突明显稀疏、长度缩短，细胞活力显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，低剂量组和去铁酮组的细胞损伤情况明显改善，细胞数目明显增加，形态明显规整，树突明显增加，细胞活力显著升高（P＜0.01）。细胞活力检测结果见图3。

图2 各组间细胞形态比较（×200）

图3 各组间细胞活力比较

3.3 不同药物对各组间细胞ROS 含量的影响

与正常组比较，模型组细胞损伤明显，ROS 含量急剧升高（P＜0.01）；与模型组比较，低剂量组和去铁酮组的细胞ROS 含量明显下降（P＜0.01）。详见图4。

图4 各组间细胞ROS 含量比较

3.4 不同药物对各组间细胞SOD 的影响

与正常组比较，模型组细胞SOD 活力显著下降（P＜0.01）；与模型组比较，低剂量组和去铁酮组的细胞SOD 活力出现明显上升趋势（P＜0.05）。详见图5。

图5 各组间细胞SOD 活力比较

3.5 不同药物对各组间细胞MDA 的影响

与正常组比较，模型组细胞过氧化损伤明显，MDA含量显著上升（P＜0.01）；与模型组比较，低剂量组和去铁酮组的细胞MDA 含量明显下降（P＜0.01）。详见图6。

图6 各组间MDA 含量比较

3.6 Western blot 检测TFR、HEP、FPN 蛋白的表达水平

与正常组比较，模型组TFR 和HEP 蛋白表达显著增加（P＜0.01），FPN 蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，低剂量组和去铁酮组TFR和HEP 蛋白的相对表达量均有不同程度下降（P＜0.05），FPN 蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）。 详见图7。

图7 各组间TFR、HEP、FPN 蛋白表达水平比较

4 讨论

临床调查数据显示，中国是世界上卒中发病率较高的国家之一，其中缺血性卒中占我国卒中分型的69.6%～70.8%[13-14]。 研究发现，兴奋性毒性、离子失衡、氧化应激和细胞凋亡等因素均可导致脑组织功能障碍，从而加重脑卒中的损伤[15-16]。 铁是人体最丰富的过渡金属元素，在生理状态下铁摄取、利用及储存处于稳态；病理情况下，铁超载可引起细胞内过氧化反应，铁稳态被打破[17]。铁聚集性沉积可导致肝脏、心脏等器官出现病变，脑卒中后铁沉积通过Fenton 反应加重神经系统功能紊乱[18-19]。

TF 是一类可逆的结合铁的糖蛋白，与TFR 结合后形成复合体，通过胞吞方式将铁转运至细胞内[20-22]。FPN 是目前已知唯一的膜铁输出蛋白，在各种细胞中FPN 蛋白的表达普遍存在[23]。 HEP 被认为是机体铁代谢转运系统的主要调节分子，其表达受到炎症和激素等信号通路的调节[24-26]。 研究发现，HEP 能够与FPN 直接作用，促进FPN 内化降解，同时抑制十二指肠处的铁吸收和利用[27]，二者形成的HEP-FPN轴作用于人体参与了人体铁代谢的各个阶段，并维持铁的动态平衡，发挥调控机体铁稳态的作用[28-29]。

补阳还五汤是治疗中风气虚血瘀证的经典方剂，由清代医家王清任创立。 黄芪补气升阳、养血通痹，为君药；当归活血祛瘀、补血，为臣药；赤芍散瘀止痛、活血凉血；川芎活血行气；地龙通络化瘀；桃仁祛瘀活血；红花活血通经、散瘀止痛。 诸药同用，共奏活血通络祛瘀之效。 研究发现，补阳还五汤中的药物成分具有扩张血管、改善微循环的作用，能够有效改善脑缺血组织损伤[30]。现代研究表明，补阳还五汤可以促进脑缺血损伤区域的血管生成，增加脑血流量，为梗死区域及周围组织输送氧气和营养物质，促进新生细胞向神经元分化，通过多途径、多靶点促进神经功能恢复等[31-32]。 吴万丰等[33]通过分析补阳还五汤干预后缺血性卒中大鼠的肠道菌群以及血浆代谢产物，认为补阳还五汤通过抗氧化参与缺血性卒中的神经保护机制，并降低缺血性脑卒中血液高凝状态。 临床资料分析表明，卒中恢复期使用补阳还五汤治疗有明显效果[34]。此外，由补阳还五汤临证化裁而研制的中药复方也可明显抑制神经细胞过氧化造成的损伤，减少脑神经细胞缺血性损害[35]。

本实验通过模拟半体内环境，以补阳还五汤为干预药物，探讨其调控脑缺血后铁稳态失衡，改善神经元损伤的作用机制。 由实验结果可得知不同浓度补阳还五汤对损伤神经元均具有一定改善作用，低剂量浓度改善作用最显著，细胞活性和形态较其他剂量组均有明显改善。 去铁酮片中的主要成分是去铁酮，一种与铁离子螯合清除机体多余铁的螯合剂。 既往研究发现，去铁酮可以通过下调脑缺血后TFR 的表达并上调FPN 的表达，促进缺血后铁外排，降低缺血后铁的异常沉积[36]。 当铁稳态失衡时，细胞摄铁量增加，排铁量减少，最终导致铁沉积。 过量沉积的铁诱导ROS 产生，激活氧化应激反应[37]。补阳还五汤干预后细胞活性的增加和ROS 含量的降低趋势与去铁酮组基本一致，细胞的损伤形态明显改善。通过对造模后干预处理的细胞进行SOD 与MDA 检测结果表明，补阳还五汤和去铁酮进行干预后的细胞损伤情况与模型组相比得到改善，SOD活力显著上升，MDA 含量下降，即细胞对抗自由基继发损伤的能力提高，并且部分细胞过氧化损伤有所改善。 TF 与TFR 结合，将铁转运至细胞内后，诱导细胞内Smads 信号转导蛋白磷酸化，p-Smads 与Smad4 结合并进入细胞核促进HEP 的表达，HEP 高表达可增加FPN 的泛素化与降解，导致铁沉积，加重损伤[38]。 通过实验数据可看出，与模型组比较，补阳还五汤和去铁酮进行干预后，TFR、HEP 蛋白的表达明显降低，FPN 表达明显增加，表明补阳还五汤可以改善细胞损伤后铁代谢转运蛋白紊乱的状态，TFR 与HEP 表达降低，减少铁离子输入，FPN 表达增加，可有效促进铁外排。由此推测补阳还五汤可能是通过抑制TFR 的表达，降低HEP 的产生，改善下游FPN 内化降解现象，在铁输入与输出蛋白的协同作用下，促进神经元损伤后铁沉积外排，增加细胞抗氧化能力，发挥改善脑缺血神经元损伤的作用。