滋肾活血方对血管性痴呆大鼠分裂与融合蛋白Mfn1、Mfn2、Drp1、Fis1 的影响

秦 茂，伍大华*，张秀丽，谢 乐

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南省中医药研究院附属医院脑病科，湖南 长沙 410006

血管性痴呆（vascular dementia, VD）是由脑血管疾病危险因素(例如高血压、糖尿病、高脂血症等)或非明显性脑血管疾病(例如脑白质变性、慢性脑缺血)引起的进行性神经认知综合征。近几年来，VD 的发病率呈逐步上升趋势，给患者及其家庭以及社会带来极大的负担[1]。 VD 病因复杂，临床表现多样，现代研究表明其发病与脑组织受损相关[2-3]。 在治疗上，西医尚无明确特效药物。 有研究表明，线粒体功能损伤、能量代谢失常是VD 的重要机制之一[4-5]。滋肾活血方是湖南中医药大学附属中西医结合医院国医大师刘祖贻基于中医痴呆病“肾精阴虚，瘀阻脑络”的基本病机所创，具有滋肾填精、活血通络的功效，临床疗效显著[6]。有研究证实，滋肾活血方能改善VD 患者的认知功能和中医证候[7-8]。 课题组研究发现，滋肾活血方可提高VD 大鼠学习和记忆能力，其机制可能与调节VD 大鼠脑组织蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)、磷酸化蛋白激酶B（phosphorprotein Kinase B, p-Akt）、酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor, TrkB)、脑源性神经营养因子(brainderived neurotrophic factor, BDNF)蛋白的表达有关[9]。本文研究滋肾活血方对VD 大鼠蛋白表达的影响，探讨滋肾活血方治疗VD 的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SD 大鼠60 只，雄性，鼠龄6～8 周，体质量220～250 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验场所：湖南中医药大学实验动物中心，使用许可证编号：SYXK（湘）2019-0009。 动物实验室要求光照充足、通风和空调设备良好。饲养室温为20～25 ℃、相对湿度为50%～70%。实验室按常规定期清洁、消毒。 自由摄取食物和饮水。

1.2 药品及主要试剂、仪器

滋肾活血方由制何首乌15 g、枸杞子30 g、桑椹30 g、五味子5 g、丹参30 g、葛根30 g、益智仁10 g、石菖蒲10 g、郁金10 g、远志10 g、全蝎3 g、山楂15 g 组成，均为颗粒剂，购自四川新绿色药业科技发展有限公司，批号分别为21020068、21080009、20080008、21070116、21050010、20030112、20060161、20120087、21030024、21060005、20100102、21080088。使用时取相应药物溶于蒸馏水配成中药混悬液，水浴加热至其完全溶解，4 ℃保存备用，灌胃前于37 ℃水浴加热。 盐酸多奈哌齐片（忆知）生产自浙江华海药业股份有限公司，批号：1426A18002，国药准字：H20183418。

线粒体融合蛋白1（mitofusin 1, Mfn1）抗体（批号：00070973，武汉三鹰生物技术有限公司）；线粒体融合蛋白2（mitofusin 2, Mfn2）（批号：AC02195823）、线粒体动力蛋白相关蛋白1（dynamin-related protein 1,Drp1）（批号：AB02902356）、线粒体分裂蛋白1（fission mitochondrial 1, Fis1）（批号：AG07194254）抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司；4%多聚甲醛（批号：21295584，广州赛国生物科技有限公司）；显色试剂盒、通用二步法试剂盒（批号：2111A0525、2126F0627）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；柠檬酸钠（批号：1114A0148，北京索莱宝科技有限公司）。

Leica UC7 型切片机（德国Leica 公司）；TH4-200 型倒置显微镜（日本Olympus 公司）；SMART V3.0 型动物行为学软件追踪系统（美国Harvard Apparatus 公司）。

1.3 动物造模

采用改良2-VO 法[10]制作VD 大鼠模型。随机留取10 只大鼠不予结扎造模，剩余50 只进行造模。大鼠术前12 h 禁食、4 h 禁水。 大鼠用水合氯醛腹腔麻醉，固定于板上。 颈正中线切开，钝性分离左侧颈总动脉，而后以外科线双重结扎，术后于小鼠大腿肌肉丰厚处肌内注射青霉素钠30 万U/kg。 在7 d后进行相同操作，结扎右侧颈总动脉。 假手术组不予结扎。 模型成功的判断：第2 次结扎术后1 周进行水迷宫测试[11]，前4 天为训练，依次从4 个象限将大鼠扔入，若大鼠未在60 s 内站上平台，将其引导至平台上站立10 s；第5 天从平台所在象限的对侧将大鼠扔入水池，各组大鼠上水中平台所需时间即为逃避潜伏期（escape latency, EL），60 s 内未上则记为60 s；对每组的EL 进行记录，以假手术组大鼠EL 的平均值为参考值，计算造模大鼠与假手术组大鼠EL 之差占该鼠EL 的比值，若该值＞20%则为2-VO模型造模成功[12]。

1.4 动物分组及给药

未结扎大鼠10 只标记为假手术组。 将造模成功大鼠按随机数字表法分为模型组、滋肾活血高剂量组、滋肾活血中剂量组、滋肾活血低剂量组、西药组，每组10 只。 每组大鼠按9 mL/(kg·d)剂量灌胃相应药物。 模型组、假手术组给予蒸馏水，滋肾活血低剂量组、滋肾活血中剂量组、滋肾活血高剂量组分别予以相当于0.5、1、2 倍人常规剂量滋肾活血方溶液[9.8、17.8、35.6 g/(kg·d)]灌胃，西药组以相当于人常规剂量的多奈哌齐溶液[150 mg/(kg·d)]灌胃，中药及多奈哌齐剂量均参照徐叔云主编《药理实验方法学》[13]换算，采用灌胃法喂药，每天1 次，连续2 周。

1.5 行为学检测

末次灌胃的第2 天再次进行水迷宫实验，方法参考“1.3”，对每组大鼠EL 进行记录，评估各组大鼠学习记忆功能。

1.6 免疫组化法检测大鼠海马组织Mfn1、Mfn2、Drp1、Fis1 蛋白表达

大鼠处死后取海马组织，4%多聚甲醛固定，切片，二甲苯脱蜡3 次，乙醇洗脱，将切片置于柠檬酸钠溶液中进行抗原修复，加入过氧化酶阻断剂以阻断内源性过氧化氢酶的活性，加入50 μL 用稀释液稀释后的一抗，室温孵育1 h，加入50 μL 二抗（生物素标记的羊抗鼠/兔IgG），室温孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。倒置显微镜下观察，棕黄色结构为阳性表达，使用Image-Pro Plus 6.0 软件检测阳性结构的面积和强度（光密度），采用平均光密度值来表示阳性表达的水平。

1.7 统计学方法

采用SPSS 28.0 统计软件处理数据。 计量资料采用“±s”表示，组间比较运用ONE-ANOVA 分析。P＜0.05 为差异具有统计学意义，P＜0.01 为差异具有显著统计学意义。

2 结果

2.1 滋肾活血方对大鼠学习记忆功能的影响

与假手术组比较，模型组大鼠EL 明显延长（P＜0.05），说明造模成功。与模型组对比，滋肾活血低剂量组、滋肾活血中剂量组、滋肾活血高剂量组、西药组的大鼠EL 明显缩短（P＜0.05）。与滋肾活血低剂量组比较，滋肾活血中剂量组、滋肾活血高剂量组EL均缩短（P＜0.05）。 详见表1。

表1 各组大鼠EL 比较（±s，n=10）

表1 各组大鼠EL 比较（±s，n=10）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与滋肾活血低剂量组比较，△P＜0.05。

EL/s 11.000±7.211 34.000±14.107*22.670±13.317#12.330±4.933#△12.330±11.676#△12.500±6.028#组别假手术组模型组滋肾活血低剂量组滋肾活血中剂量组滋肾活血高剂量组西药组

2.2 滋肾活血方对大鼠海马组织线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2、Drp1、Fisl 表达的影响

与假手术组比较，模型组Mfn1、Mfn2、Drp1 蛋白表达量均降低（P＜0.01）；与模型组比较，滋肾活血低剂量组、滋肾活血中剂量组、滋肾活血高剂量组、西药组Mfn2、Drp1 蛋白表达量均升高（P＜0.01），滋肾活血中剂量组、滋肾活血高剂量组Mfn1 蛋白表达量均升高（P＜0.01），滋肾活血低剂量组Mfn1 蛋白表达量降低（P＜0.01）。与滋肾活血低剂量组比较，滋肾活血中剂量组、滋肾活血高剂量组Mfn1、Drp1 蛋白表达量均升高（P＜0.05）。各组Fisl 蛋白表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。 详见表2、图1～4。

表2 各组大鼠海马组织Mfn1、Mfn2、Drp1、Fis1 蛋白表达的平均光密度值（n=10，±s）

表2 各组大鼠海马组织Mfn1、Mfn2、Drp1、Fis1 蛋白表达的平均光密度值（n=10，±s）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与滋肾活血低剂量组比较，△P＜0.05。

组别假手术组模型组滋肾活血低剂量组滋肾活血中剂量组滋肾活血高剂量组西药组F 值P 值Mfn1 0.318±0.006 0.297±0.018**0.282±0.013##0.330±0.040##△0.364±0.066##△0.297±0.003 12.021＜0.01 Mfn2 0.318±0.032 0.315±0.015**0.345±0.053##0.346±0.017##0.354±0.051##0.363±0.018##5.039＜0.01 Drp1 0.313±0.015 0.273±0.018**0.294±0.018##0.342±0.012##△0.342±0.057##△0.293±0.001##16.991＜0.01 Fis1 0.309±0.024 0.307±0.044 0.311±0.019 0.318±0.022 0.316±0.030 0.320±0.039 0.500 0.775

图1 各组大鼠海马组织Mfn1 蛋白表达比较

图2 各组大鼠海马组织Mfn2 蛋白表达比较

3 讨论

VD 在中医学中属于“呆病”“痴呆”“善忘”等范畴，其病位在脑，涉及心、脾、肝、肾多脏，病性虚实夹杂，多因脏腑功能逐渐衰退，肾精亏损，髓海失养，气血不足，痰浊内生，瘀血阻窍所致。 相关文献指出其证型多集中在肾虚、痰浊、瘀血、气血等方面[14]。西医目前尚未有明确特效药针对治疗，其主要思路是对症治疗，延缓病情恶化进程，并对认知能力继发症状进行治疗，临床上乙酰胆碱酯酶抑制剂、N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDA）受体拮抗剂、抗炎药物、脑代谢激动剂、雌激素、抗氧自由基脑保护剂等均对VD 有良好的疗效[15-20]。滋肾活血方为国医大师刘祖贻指导下所创，以活血通窍、滋阴补肾、益智健脑为治法，临床用于治疗VD取得了良好疗效， 能有效改善VD 患者的认知功能和中医证候[7-8]。

图3 各组大鼠海马组织Drp1 蛋白表达比较

图4 各组大鼠海马组织Fis1 蛋白表达比较

课题组前期研究发现，滋肾活血方能显著提高VD 大鼠海马组织自噬相关蛋白表达，促进细胞自噬，保护VD 大鼠神经元，改善其学习记忆能力[21]。VD 是唯一可防治的痴呆疾病[22]，中医在防治VD 方面取得了良好进展[23]。 近年来，有研究提出，线粒体融合与分裂的异常可能是许多中枢神经系统疾病的发病机制之一[24]。故而，本文通过研究滋肾活血方对大鼠海马细胞内线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2，线粒体分裂蛋白Drp1、Fis1 表达的影响，进一步探究滋肾活血汤治疗VD 的作用机制，从而为临床提供新思路，以期为今后中医发展提供新方向，使中医药在防治脑病方面更进一步。

本研究结果显示，滋肾活血方与多奈哌齐均有调节线粒体融合蛋白Mfn2、线粒体分裂蛋白Drp1表达的作用，经滋肾活血方干预后，Mfn1 蛋白表达量升高，而多奈哌齐干预后Mfn1 蛋白表达量改变不明显，课题组讨论后认为多奈哌齐可能不影响Mfn1 蛋白的表达。 滋肾活血方组内对比发现，滋肾活血中剂量组、滋肾活血高剂量组Drp1、Mfn1 蛋白表达量明显高于滋肾活血低剂量组，课题组讨论后认为结果差异考虑与剂量有关。 通过实验发现，多奈哌齐、滋肾活血方均可能对线粒体融合、分裂具有调节作用。 有文献指出，人体细胞中Drp1 蛋白的活性可能不受Fis1 蛋白沉默或过表达的影响[25]，故Fisl蛋白在海马组织中是否具有维持线粒体功能稳定的作用，值得进一步实验探讨。 通过本研究，课题组认为滋肾活血方在临床上改善认知功能的机制可能与调节细胞内线粒体分裂与融合有关。