防脱育发精华液对雄激素性脱毛大鼠局部皮肤睾酮、双氢睾酮、肝细胞生长因子水平的影响

谭素芳，程 晓，徐翠萍，钟 昕，周 琦，刘朝圣*

1.湖南中医药高等专科学校，湖南 株洲 412012；2.湖南中医药大学第一附属医院皮肤科，湖南 长沙 410007；3.湖南中医药高等专科学校附属第一医院，湖南 株洲 412000

脱发是皮肤科中的常见病、多发病。 其中，雄激素性脱发，又名男性型脱发，发病率占脱发的90%，是目前导致脱发的第一大原因，具有反复发作、缠绵难愈的特点。临床主要表现为前额及两侧鬓角发际线上行及头顶毛发稀疏，常伴油腻、脱屑、瘙痒等症[1-3]，具有反复发作、缠绵难愈的特点[4]。

中医学认为精血为头发化生之源，精血不足、肝肾亏虚则无以濡养肌肤毛发，或长期精神压力过大，肝郁气滞，气行不畅，进而气滞血瘀，发失所养。中药复方具有疗效确切、不良反应少的优点。从中药中筛选防治雄激素性脱发的处方，是防治雄激素性脱发药物开发的一种新尝试。 防脱育发精华液是广东芙妍化妆品公司历时20 余年研发的一款用于治疗雄激素性脱发的外用洗剂，由《本草纲目》七宝美髯丹加减化裁研制而成，主要由女贞子、何首乌、菟丝子、侧柏叶、苦参、艾叶、川芎、花椒等中药组成，具有固发防脱、祛风止痒的功能。 本课题组前期研究显示，防脱育发液在控制头痒和头油症状、减少脱发数量及促进新发生长方面临床疗效确切，且在研究过程中未发生不良反应[5]。

本研究以雄激素性脱毛大鼠模型为实验载体，观察大鼠毛发生长及睾酮（testosterone, T）、双氢睾酮（dihydrotestosterone, DHT）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）表达的变化，探讨其作用机制，为临床应用提供客观依据。

1 材料

1.1 实验动物

6 周龄雄性SPF 级SD 大鼠45 只，体质量180～220 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，生产许可证号：SYXK（湘）2020-0010。 饲养于湖南中医药大学东塘校区SPF 级动物实验中心，严格按照动物伦理学要求善待动物（动物实验伦理审批号：ZYFY20220513-40）。

1.2 主要药物与试剂

防脱育发精华液（广东芙妍化妆品有限公司，批号：20210221）；米诺地尔酊（浙江万晟药业有限公司，批号：20210927）；丙酸睾酮（上海凛恩科技发展有限公司，批号：R002673）；大鼠T 试剂盒（批号：MM-0577R1）、大鼠DHT 试剂盒（批号：MM-0532R1）均购自江苏酶免实业有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：EBC-K318-M）；HGF（北京安诺伦生物科技有限公司，批号：26881-1-ap）。

1.3 主要仪器

低温高速离心机（德国Eppendorf 公司，型号：5424R）；电子天平（上海奥豪斯仪器有限公司，型号：PX224ZH）；超高灵敏度化学发光成像系统（上海伯乐生命医学产品有限公司，型号：Chemi DocTMXRS+）；全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司，型号：Tanon-5200）。

2 方法

2.1 动物分组

适应性喂养3 d，用Excel 软件随机分为空白组、对照组、模型组、米诺地尔酊组、防脱育发液精华组，每组各9 只。

2.2 动物造模及给药

将丙酸睾酮用花生油进行稀释，待混匀后配成浓度为5 mg/mL 的溶液。参照文献[6-8]构建动物模型，空白组无干预措施，对照组皮下注射生理盐水外，其他组皮下多点注射5 mg/kg 的丙酸睾酮，每天上午注射1 次，连续35 d。 大鼠颈背部观察区毛发出现脱落、稀疏现象，提示造模成功。 由于本实验周期较长，动物局部雄激素受体具有可逆性[8]，因此，造模成功后需持续皮下注射丙酸睾酮，此后丙酸睾酮的注射剂量减半[9-10]。

造模的同时进行药物干预，皮下注射造模30 min后，将药物涂于脱毛实验观察区内。 给药剂量参照《实验动物学基础与技术》[11]，通过人与大鼠体表面积比换算出大鼠的用药量。 空白组和模型组涂赋型剂（生理盐水），其余组予相应的治疗药物，每天给药1 次，连续35 d。

2.3 观察指标

2.3.1 一般状态观察 每天观察大鼠的精神状态、毛色、脱毛、体质量、饮食量、二便等情况。

2.3.2 ELISA 法测定大鼠局部皮肤组织中T、DHT含量 实验第36 天后， 将大鼠麻醉，75%乙醇局部消毒，镊子捏起大鼠背部皮肤，取1 g 新鲜皮肤组织，加入9 g PBS 缓冲液，匀浆离心，收集上清液，按照相应试剂盒说明，用ELISA 法测定皮肤中的T、DHT含量。

2.3.3 免疫组化及Western blot 检测局部皮肤组织中HGF 蛋白表达 实验第36 天后，将大鼠麻醉后取新鲜皮肤组织固定，按照免疫组化流程，经石蜡切片、抗原修复、淋洗、封闭、敷一抗、敷二抗、显色复染等操作，对HGF 的蛋白表达水平进行测定。 另一部分新鲜皮肤组织采用BCA 测定法，提取蛋白并检测浓度、制胶、上样、电泳、转膜、封闭、孵育一抗、孵育二抗、曝光等流程，检测局部皮肤组织中HGF 蛋白相对表达量。

2.4 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计软件进行数据分析。计量资料以“±s”表示，当资料满足正态分布和方差齐性时，采用完全随机设计多组ANOVA 分析，并采用LSD-t法进行多重比较，否则采用Kruskal-wallis H 检验；体质量变化情况采用重复测量方差分析。 以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠一般状态

SD 大鼠毛发丰富，喜舔舐毛发，实验过程中空白组观察区毛发呈现出浓密、洁白、柔顺，未见明显脱落；对照组基本不见裸露皮肤；模型组、米诺地尔酊组、防脱育发精华液组在连续皮下注射丙酸睾酮3周后，毛发失去光泽，颜色变灰暗，于4 周后逐渐出现毛发稀疏、脱落现象，存留的毛发变得易油腻、纤细、质脆，偶见小块裸露皮肤，毛发脱落于第5 周尤为明显。实验过程中各组间体质量变化比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。 详见图1、表1。

表1 各组大鼠体质量变化比较（±s，n=9）

组别空白组对照组模型组米诺地尔酊组防脱育发精华液组第1 周248.88±6.75 245.88±6.62 258.27±7.79 255.46±12.41 246.15±13.04第2 周310.98±6.78 306.81±11.47 318.56±14.51 312.32±19.19 308.73±18.95第3 周324.05±11.29 324.61±10.59 339.18±19.57 339.67±18.61 339.67±18.61第4 周353.44±20.88 349.56±18.37 356.89±19.37 355.44±21.70 346.56±24.99第5 周383.56±29.90 380.78±33.72 382.78±27.19 390.67±27.16 361.67±50.78

图1 各组大鼠局部毛发状态比较

3.2 各组大鼠局部皮肤组织中T、DHT 含量

与空白组比较，模型组T、DHT 含量均明显升高（P＜0.05，P＜0.01）。 对照组与空白组间T、DHT 含量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。 与模型组比较，米诺地尔酊组、防脱育发精华液组T、DHT 含量均明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。 与米诺地尔酊组比较，防脱育发精华液组DHT 含量明显降低（P＜0.05）。米诺地尔酊组与防脱育发精华液组间T 含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 详见表2。

表2 各组大鼠局部皮肤组织中T、DHT 含量比较（±s，n=9）

表2 各组大鼠局部皮肤组织中T、DHT 含量比较（±s，n=9）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与米诺地尔酊组比较，ΔP＜0.05。

组别空白组对照组模型组米诺地尔酊组防脱育发精华液组T/（pg·mL-1）154.784±4.276 160.132±16.403 203.012±15.851**167.487±10.173##159.842±10.685##DHT/（nmol·L-1）5.802±0.277 5.909±0.272 6.592±0.524*6.170±0.670#5.635±0.322##Δ

3.3 各组大鼠局部皮肤组织中HGF 蛋白表达情况

免疫组化结果显示：与空白组及对照组比较，模型组HGF 蛋白表达水平均明显降低(P＜0.05)。 空白组与对照组组间HGF 蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 与模型组比较，防脱育发精华液组HGF蛋白表达水平明显升高(P＜0.05）。 米诺地尔酊组与防脱育发精华液组间HGF 蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 详见图2、表3。

图2 各组大鼠皮肤组织HGF 蛋白表达免疫组化图（×10）

表3 各组大鼠皮肤组织HGF 蛋白表达水平比较（免疫组化，±s，n=9）

表3 各组大鼠皮肤组织HGF 蛋白表达水平比较（免疫组化，±s，n=9）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与对照组组比较，&P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

HGF 5.086±2.026 6.633±1.691 2.599±0.326*&3.583±0.446 5.343±1.155#组别空白组对照组模型组米诺地尔酊组防脱育发精华液组

Western blot 结果显示：与空白组比较，对照组HGF 蛋白相对表达量明显升高（P＜0.05），模型组HGF 蛋白相对表达量明显降低（P＜0.05）。 与对照组比较，模型组HGF 蛋白相对表达量明显降低（P＜0.01）。与模型组比较，米诺地尔酊组、防脱育发精华液组HGF 蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05）。米诺地尔酊组与防脱育发精华液组间HGF 蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。详见图3、表4。

图3 各组大鼠HGF 蛋白表达电泳图

表4 各组大鼠皮肤组织HGF 蛋白相对表达量比较（±s，n=9）

表4 各组大鼠皮肤组织HGF 蛋白相对表达量比较（±s，n=9）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与对照组组比较，&P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

HGF 0.150±0.027 0.229±0.053*0.079±0.013*&0.163±0.047#0.191±0.029#组别空白组对照组模型组米诺地尔酊组防脱育发精华液组

4 讨论

雄激素性脱发是一种以进行性的毛囊微小化为主要病理表现的毛发进行性减少的疾病，其发病机制主要与遗传、性激素、皮脂腺分泌、局部微环境、精神压力、饮食等因素有关[11-12]。 皮下注射丙酸睾酮注射液是通过局部皮肤区域注射游离T，经5α-还原酶作用转化为活性更高的DHT，DHT 随即与其受体结合形成雄激素-受体复合物，逐渐使毛囊微小化[13]，最终导致脱发。现代医学治疗脱发的常用方法有激素调节剂、生物反应学调节剂、光化学疗法、手术移植等，有一定的治疗效果，但有不同程度的不良反应[14-15]。

防脱育发精华液由女贞子、何首乌、菟丝子、侧柏叶、苦参、艾叶、川芎、花椒等中药组成。 方中制何首乌性微温、味甘涩，归肝、肾经，发挥补益肝肾精血，固肾涩精乌须之功，为君药。 菟丝子、女贞子、灵芝共为臣药，菟丝子归肝、脾、肾经，补肾填精；女贞子归肝、肺、肾三经，补肝肾、明目乌发；灵芝归心、肺、肝、肾经，补气安神、扶正固本。侧柏叶凉血、生发黑发，归肺、肝、大肠经；苦参归心、肝、胃、大肠、膀胱经，清热燥湿杀虫、凉血、生发黑发；血中之气药川芎归肝、胆经，行气活血止痛，艾叶归肝、脾、肾经，温经通络、散寒止痛，共为佐药。花椒归脾、胃、肾经，辛香走窜，温中散寒除湿，载药达毛窍，为使药。 以上诸药相辅相成，共奏固发防脱、祛风止痒之功。

本研究实验结果表明防脱育发精华液对雄激素性脱毛大鼠毛发脱落具有改善作用，主要表现在较模型组大鼠而言，防脱育发精华液组大鼠毛发油腻程度减轻，毛干差异小，毛发不易梳落、打结。本次实验结果提示，防脱育发精华液能提升HGF 表达水平，在实验过程中两种方法检测HGF 蛋白表达，均显示对照组HGF 蛋白表达最高。 HGF 是一种多功能生长因子[16]，它在肝细胞中发挥作用并刺激再生[17-18]的同时，对肝外组织和细胞的有丝分裂或营养也有促进作用。 本次实验过程中相较于空白组无干涉措施，对照组伴随皮下注射这种微小的创伤性刺激，能使局部区域血管内皮生长因子分泌增多，进而刺激上皮细胞[19]、黑素细胞和内皮细胞的生长和功能发挥。中医外治法中常用梅花针叩刺[20]局部皮肤治疗脱发，发挥调和营卫气血、通经活络的作用，殊途同归。

本次实验中局部皮肤组织的DHT 降低明显，由此推测防脱育发精华液可通过改善局部毛囊雄激素受体水平，改善毛发脱落等现象，但雄激素性脱发病因病机复杂，亦可进一步研究本品是否具有抑制局部皮肤5α-还原酶作用。

综上所述，本研究提示防脱育发精华液对促进雄激素性脱毛大鼠毛发生长，其机制可能是改善局部毛囊雄激素受体水平，降低DHT 含量，促进HGF表达，其他方面的作用机制还有待进一步研究。