基于农业废弃物培育优质蛹虫草的研究

陈丽媛, 朱万芹, 孙翠焕, 李剑梅, 陈 杰, 张疏雨, 柴林山, 赵博伦

(辽宁省微生物科学研究院,辽宁 朝阳 122000)

蛹虫草(Cordycepsmilitaris)又名北冬虫夏草、北虫草,属子囊菌亚门(Ascomycota)核菌纲(Pyrenomycetes)球壳目(Sphaeriales)麦角菌科(Clavicipitaceae)虫草属(Cordyceps)真菌[1]。具有降血糖、降血脂、抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗氧化和免疫调节等药理作用[2-4],作为传统药食两用真菌,因其营养及经济价值备受人们喜爱,我国自20世纪80年代发现并分离蛹虫草以来,栽培技术发展迅速,已初步实现规模化种植[5-6],且不受季节限制。一直以来栽培原料主要为大米、麦粒[7-8],原料成本远远高于其他食用菌品种[9-10]。我国是农业大国更是人口大国,资源短缺,耕地有限,节粮减损关系国家发展稳定[11-13]。蛹虫草种植的经济效益高于传统基础农业,已经成为部分农民脱贫致富的支柱产业,随着农民种植技能的提高和成熟,种植规模不断扩大,产生大量蛹虫草培养基废弃物,质量约是蛹虫草干品的6～8倍,原料浪费达30%,给生产环境带来了巨大压力和困扰[14],培养基废弃物亟待处理。目前,培养基废弃物缺乏有效的再利用途径,污染自然生态环境和再生产环境,制约了虫草产业的可持续发展[5]。中国土地沙漠化导致农业耕地面积不断减少,能够作为主食的抗逆性甘薯作物种植在不断推进。甘薯因抗干旱、耐瘠薄、环境适应性强、高产稳产等特点,已成为我国主要栽培的农作物品种之一,种植面积约1 100万hm2,占世界甘薯种植面积的65%以上,其栽培面积和产量均居世界首位[15],我国每年生产的甘薯藤[16]高达150亿 t以上[15]。除极少部分被利用外大部分被弃置田边或被焚烧,不仅污染了生态环境造成生产的不便,又造成了资源的浪费[17]。甘薯藤具有多种活性成分[18-21],民间中医常以甘薯藤作为降血脂、降血糖、预防和治疗动脉硬化、心脑血管、癌症疾病等的辅助治疗药食材,这与蛹虫草的研究功效一致,为用甘薯藤参与蛹虫草的培养提供了思路。本研究以农业废弃物甘薯藤及蛹虫草培养基废弃物代替蛹虫草培养用粮进行蛹蝉栽培,不仅降低污染,变废为宝,还实现了蛹虫草可持续发展。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 蛹虫草(Cordycepsmilitaris)由辽宁省微生物菌种保藏中心提供。麦粒(市售),甘薯藤(当地收购),土豆(市售)。

1.1.2 培养基 ①试验组一级斜面培养基：土豆100 g/L,蛹虫草培养基废弃物20 g/L,甘薯藤粉10 g/L,葡萄糖10 g/L,蛋白胨2.5 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L,KH2PO43 g/L,维生素B110 mg/L,琼脂11 g/L。②试验组二级液体摇瓶培养基：土豆100 g/L,蛹虫草培养基废弃物20 g/L,甘薯藤粉10 g/L,葡萄糖10 g/L,蛋白胨2.5 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L,KH2PO43 g/L,维生素B110 mg/L。③试验组子实体培养基(质量分数,%)：麦粒10～80,蛹虫草培养基废弃物20～80,甘薯藤粒0～20混合,与营养液(MgSO4·7H2O 0.5 g/L,KH2PO42 g/L,甘氨酸0.1 g/L)比例为1 g∶(1.6～1.8) g/mL。④对照组一级斜面培养基：土豆200 g/L,葡萄糖20 g/L,蛋白胨5 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L,KH2PO43 g/L,维生素B110 mg/L,琼脂11 g/L。⑤对照组二级液体摇瓶培养基：土豆200 g/L,葡萄糖20 g/L,蛋白胨5.0 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L,KH2PO43 g/L,维生素B110 mg/L。⑥对照组子实体出草培养基：麦粒与营养液(MgSO4·7H2O 0.5 g/L,KH2PO42 g/L,甘氨酸0.1 g/L)加入比例为1 g∶(1.6～1.8) g/mL。

1.1.3 主要试剂与仪器设备 葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、芦丁标准品(纯度98%,上海润捷化学试剂有限公司),无水乙醇(天津市汇航化工公司),NaOH、Al(NO3)3、NaNO2(分析纯,天津大茂化学试剂厂),用水为蒸馏水。生物安全柜(BHC-1300IIA/B2,上海立申科学仪器有限公司);分光光度计(723,上海菁华科技仪器有限公司);高效液相色谱仪(Waters2695,Waters公司);电热鼓风干燥箱(DHG-9240A,上海一恒科学仪器有限公司);水浴锅(SL-H-4,江苏荣华仪器制造有限公司);数控超声波清洗器(KQ-50DA,昆山市超声仪器有限公司);电子天平(AL 204,梅特勒-托利多仪器有限公司);立式恒温摇床(上海世平仪器设备有限公司);万能粉碎机(常州瞬干干燥设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 主要培养原料的获得 ①甘薯藤粒(Sweetpotato stem Granules,SSG)、甘薯藤粉获得方法：挑选出秋季采完甘薯后新鲜、无霉变、无腐烂、非木质化的甘薯藤,洗净,淋干水分,放入粉碎机中粉碎成2～3 cm小段,置于鼓风干燥箱中60～80 ℃烘干至含水量达到8%～12%装袋备用。根据需要：粉碎至4～8目,得甘薯藤粒;粉碎至20～40目,得甘薯藤粉。②蛹虫草培养基废弃物获得方法：挑选无霉变、无杂菌污染、无污物,蛹虫草菌丝体丰富的采收完蛹虫草子实体的新鲜培养基,并剔除子实体残段做为原料,该废弃物经过子实体胞外酶酶解降低了韧性,易于断裂。可用揉搓机搓碎分散,粒径0.4～0.6 cm,置于鼓风干燥箱中60～80 ℃烘干至含水量达到8%～12%装袋备用。

1.2.2 一级斜面菌种驯化 试验组：将土豆、蛹虫草培养基废弃物、甘薯藤粉煮沸20～25 min,过滤得滤液,分别加入葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾、维生素B1、琼脂充分溶解,装入试管,121 ℃灭菌30 min,无菌接入蛹虫草斜面菌种,18～22 ℃避光培养,待菌丝长满斜面后低温保存。对照组：采用对照组一级斜面培养基,培养相同菌种,菌种培养方法同试验组。

1.2.3 蛹虫草二级液体种子制备 试验组：将土豆、蛹虫草培养基废弃物、甘薯藤粉一起煮沸20～25 min,过滤得滤液,分别加入葡萄糖、蛋白胨、MgSO4·7H2O、KH2PO4、维生素B1,无菌接入一级斜面驯化菌种,18～22 ℃,140 r/min培养3.5～4.5 d,待菌丝健壮、菌球丰富,停止培养。对照组：二级液体菌种制备采用对照一级斜面菌种及对照组二级液体培养基,培养方法同试验组,二级液体菌种培养4.5～5.0 d。

1.2.4 蛹虫草子实体培养基制备 试验组营养液配制：MgSO4·7H2O 0.5 g/L,KH2PO42 g/L,甘氨酸0.1 g/L;麦粒10%～80%,蛹虫草培养基废弃物10%～80%,甘薯藤粉0～20%混合(表1),与营养液比例为1 g∶(1.6～1.8) g/mL;采用500 mL容量罐头瓶,每瓶装量35 g,将固体料称好混匀倒入培养瓶中,按比例加入营养液,上覆盖聚乙烯膜,用橡皮筋扎紧。121 ℃,灭菌60～70 min。按培养料6%～8%(体积分数)无菌接入二级液体菌种,18～22 ℃避光培养,待白色菌丝长满并覆盖瓶内培养料表面时,进入转色阶段,光照强度200～400 Lx,空气湿度60%～80%;待菌丝颜色转至橘黄色,原基突起长出时,用无菌针于培养瓶瓶口的聚乙烯膜上均匀扎孔透气,空气湿度保持85%～95%,待蛹虫草子实体顶端微膨大长至瓶口处时采收。对照组出草培养基采用麦粒培养基,营养液同试验组,出草培养同试验组(表1)。

表1 蛹虫草子实体培养基不同比例配料处理

1.2.5 试验数据分析 试验数据采用SPSS26.0软件分析处理,不同处理间的差异显著性采用LSD法检验。采用Microsoft Excel 2016软件分析数据,试验数据为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 一级斜面菌种生长状况

试验组中尽管降低了土豆、蛋白胨等营养成分,对照组及试验组菌丝粗壮、致密、整齐,质量好,均可使用,但试验组菌种生长速度较快,满管时间较短,说明在培养基中加入的蛹虫草废弃物与甘薯藤粉对蛹虫草菌丝生长有一定的促进作用,且使菌种得到了初步驯化。

2.2 二级蛹虫草液体种子生长状况

从表2可看出,试验组与对照组生长状况有一定差别,试验组中菌球稍小于对照组,菌球均匀度更好,悬浮性好,说明菌种生长状态好,使用时菌球更容易分散,子实体更易于均匀分布。同时试验组菌种生长周期短于对照组,这可能因为蛹虫草废弃物酶解后含有的小分子物质[22-23]及甘薯藤粉中的蛋白质、糖分、氨基酸等[24-27]营养物质提供了充足的营养需求和某些促生长因子,说明添加甘薯藤粉和蛹虫草培养基废弃物在一定程度上可促进菌丝及子实体生长,提升了菌种活力且使菌种得到了再驯化。

表2 蛹虫草二级菌种生长状态

2.3 蛹虫草子实体萌发情况

从表3可看出,试验组菌丝萌发时间均早于对照组,分别为24～25.7 h和28 h,菌丝覆满料面的时间比对照组时间短且差异显著,说明蛹虫草菌丝在以添加不同比例甘薯藤粒及蛹虫草培养基废弃物替代料上生长速度较快,见光转色快,形成原基早。原基萌发率一致均达到100%,说明蛹虫草菌丝在添加不同比例的甘薯藤粒及蛹虫草培养基废弃物上均能萌发。同时生长周期缩短,在一定程度上减少了人力物力,节约了能源。

表3 蛹虫草子实体萌发情况

2.4 蛹虫草子实体的生物学性状

由表4中蛹虫草子实体生物学指标可以看出,试验组T1～T7和对照组CK子实体在直径、数量、畸形率、生物学效率[28]及生长周期等方面存在一定差异,试验组T3～T7的子实体直径小于对照组且差异显著,但子实体数量多于对照组,T6～T7子实体过细品相不好;从行业内关注的生物学效率来看,试验组T1～T2组内差异不显著,与CK组间差异也不显著,T4～T7与CK差异显著,但T6～T7生物学效率偏低,而T3～T5略高于对照组,这说明甘薯藤及蛹虫草培养基废弃物对子实体产量有一定影响;试验组中T3～T5的子实体畸形率低、差异显著且品相好,商品价值高,试验组T1～T7的生长周期短于对照组,对畸形率及生长周期的影响趋势与李斯陶等[28]的研究一致,不同之处可能缘于用粮种类、菌渣、营养液、菌种、添加方式不同。缩短生长周期有利于节约能源。综合来看T3～T5生物学指标较好。

表4 蛹虫草子实体的生物学指标

2.5 蛹虫草子实体主要功效成分分析

蛹虫草子实体功能指标如表5所示,7个试验组蛹虫草子实体中虫草素、黄酮含量与对照组有一定差异。黄酮类含量均明显高于对照组,虫草素含量总体存在随着农用废弃物添加量增加而增加的趋势,这与何欢等[29]研究结果一致,说明以一定比例的农业废弃物甘薯藤及蛹虫草培养基废弃物作为替代料提高了蛹虫草子实体品质。但与表4比较发现,从生长周期、生物学效率、功能指标可看出试验组T4～T5较佳,综合来看从生物学效率、蛹虫草功能指标的提升及节粮考虑T3～T5较佳。即一级种子培养基中加入蛹虫草培养基废弃物20 g/L和甘薯藤粉10 g/L,二级种培养基中加入蛹虫草培养基废弃物20 g/L、甘薯藤粉10 g/L,蛹虫草子实体栽培料中蛹虫草培养基废弃物占32%～45%,甘薯藤粒占10%～15%,二者比例为(3～4)∶1时,经过科学的培养方法栽培效果好。试验组T6～T7栽培效果不理想,有待改进。综合来看,本研究首次尝试将蛹虫草培养基废弃物和甘薯藤用于培养蛹虫草,替代培养料用粮,具有一定的经济效益,同时兼有更明显的生态效益和社会效益。

表5 蛹虫草子实体功能指标

3 讨 论

本研究结果表明,利用甘薯藤及蛹虫草培养基废弃物部分替代蛹虫草培养料是可行的[28-29],且在节粮减排、降低成本、提高子实体品质、缩短生长周期等方面有一定优势[30]。一级种子中加入20 g/L蛹虫草培养基废弃物和10 g/L甘薯藤粉,二级种中加入蛹虫草培养基废弃物20 g/L、甘薯藤粉10 g/L,蛹虫草子实体栽培料中蛹虫草培养基废弃物占32%～45%,甘薯藤粒占10%～15%,二者比例为(3～4)∶1时,经过科学的培养方法栽培蛹虫草效果好。在菌种培养过程中用甘薯藤及蛹虫草培养基废弃物替代部分土豆、葡萄糖、蛋白胨等,可使成本降低并使菌种得到驯化,提高菌种活力。本研究改善了蛹虫草品相及生物学指标,提高了蛹虫草子实体中虫草素、黄酮等的含量,改善了蛹虫草品质。

在蛹虫草菌种培养基中添加粒径较细的甘薯藤粉时,甘薯藤中的活性物质易被充分吸收,更利于对蛹虫草菌种的驯化;在子实体培养料中添加粒径稍粗的甘薯藤粗粒,由于甘薯藤自身的组织结构及其较粗的粒径具有很好的透气性,使其在与蛹虫草培养基废弃物混合后,仍能保持较高的孔隙率,同时还具有很好的保水效果和缓释功能,一方面可在蛹虫草子实体出草培养时特别是在长出子实体原基后,大大提高菌丝生长的换气效果,进而可提高蛹虫草的生长速度,缩短培育周期,另一方面有利于菌丝生长过程中对甘薯藤中营养物质的吸收,进而提高蛹虫草子实体的生物学指标和功能指标[31-33]。

本研究利用甘薯藤、蛹虫草培养基废弃物生产蛹虫草的方法,使废弃物中的淀粉、蛋白质、糖类、氨基酸等营养物质及蛹虫草胞外酶酶解产生的小分子物质被充分利用,促进了农业废弃物资源高效生态循环利用,不仅可以减少资源浪费和环境污染,而且可以节约生产原料用粮,降低生产成本。甘薯藤质轻且富含矿物质、维生素、柔性纤维、黄酮类等物质,可提升蛹虫草品质。甘薯藤资源丰富、低成本、高营养是其优势,将其充分利用起来,变废为宝,才能利农惠农,调动农民生产积极性,促进农业生产。同时,利用蛹虫草培养基废弃物生产蛹虫草,不需远途运输,可原位就地取料,既方便又降低了运输成本,极大地促进了蛹虫草产业的高效可持续性发展。