基于线粒体CO Ⅰ基因及形态特征的喜树丛枝植原体主要媒介昆虫种类鉴定

何孟兰, 蔡银枫, 吴道慧, 苏 帆, 万琼莲, 王柱华,陈相聪, 吴艳芬, 乔 开, 蔡 红*

(1.云南农业大学植物保护学院, 昆明 650201; 2.玉溪师范学院化学生物与环境学院, 玉溪 653100)

喜树Camptothecaacuminata是我国特有树种。喜树除了观赏和木材用林以外,还有重要的药用价值,其树叶、树皮、根皮和果实都含有具有抗肿瘤作用的生物碱——喜树碱,对多种癌症有一定的疗效。喜树中抗癌物质的研究一直是一个热点,近几年也取得了巨大的进展,但随着人工种植喜树面积的逐年扩大, 喜树病虫害问题也愈发突出。早在1983年,赵建华等在贵州省南部公路旁发现种植的喜树(俗称野八角)上有丛枝病发生,借助电子显微镜观察到病株叶脉韧皮部的筛管细胞中有大量典型的植原体菌体,认为喜树丛枝病是由类菌原体(现称植原体)所致[1]。

植原体自发现以来,世界各地已报道1 000余种由其引发的病害,这些植原体所威胁的经济林木、作物、蔬菜、水果和观赏植物已达到100余种,我国也报道了70多种植物植原体病害。植原体大量存在于寄主植物的韧皮部筛管细胞中,自然条件下植原体大多依赖于通过取食韧皮部汁液的半翅目媒介昆虫以持久性传播的方式在其宿主间实现高效的传播,主要植原体媒介昆虫有叶蝉科Cicadellidae、飞虱科Delphacidae和木虱科Psyllidae等植食性昆虫。

昆虫传毒是一个植原体-昆虫-植物互作的复杂过程,媒介昆虫从染病植物获取植原体后到传播之前有一段潜伏期,因此植原体通过媒介昆虫进行传播的过程通常包括了被昆虫取食、潜伏和接种3个基本阶段。在取食阶段,媒介昆虫通过取食感病植株韧皮部汁液摄取到植原体并被吸收进昆虫的中肠内,随之植原体入侵昆虫肠细胞和邻近肌肉细胞及血淋巴,此过程被称为饲毒期或取食时间(acquisition access period,AAP)。潜伏期(latency period,LP)是媒介昆虫获取植原体后到开始具有传染性的一段时间间隔。在潜伏期期间植原体通过血淋巴侵入虫体内开始增殖并到达唾液腺。潜伏期范围为12天至一个多月,这与昆虫种类、植原体菌株或种类以及温度等非生物因素有关[2]。

本实验室研究团队前期以云南文山地区发现的具有典型丛枝症状的喜树植株和在其感病植株上发现的疑似叶蝉类昆虫为研究对象,鉴定出了5种叶蝉类昆虫并通过传毒试验筛选出喜树丛枝植原体株系媒介昆虫优势种为小绿叶蝉Empoascasp.。但对小绿叶蝉的种类和分类地位还未明确。本试验根据小绿叶蝉各龄期外部形态以及雄性外生殖器特征进行种类鉴定,并结合基于线粒体COⅠ基因序列片段的小绿叶蝉属Empoasca与部分近缘种进行分子鉴定,进一步明确其分类地位。鉴定结果可为后期喜树丛枝植原体的传毒特性及侵染循环研究奠定理论基础,为喜树植原体的综合防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

小绿叶蝉采自云南省文山市感病喜树上,用种植的健康喜树苗在温室内饲养4～5代后,采集雄成虫浸泡于无水乙醇中,放置于-20℃长期保存备用,喜树上饲养的若虫及剩余的雌雄成虫用于形态特征观察。

1.2 主要试剂及仪器

DNA 提取试剂盒、PCR 产物纯化试剂盒(购于Omega 公司),PCR 扩增高保真酶(Phanta®Max Super-Fidelity DNA Polymerase)、DNA Marker(购于南京诺唯赞生物公司),克隆载体试剂盒(pEASY®-Blunt Simple Clonging Kit)(购于北京全式金公司),Motic体视显微镜SMZ-168(购于麦克奥迪实业集团有限公司),Zeiss蔡司PrimoStar显微镜、Axiocam ERc 5s显微镜摄像机(购于北京汗盟紫星仪器仪表有限公司)。

1.3 形态学鉴定

分别在体视显微镜80、50、45、40、35、35、30倍下拍摄小绿叶蝉卵期、1～5龄若虫及成虫的形态特征。雄成虫外生殖器的解剖及鉴定方法:用自制解剖针针尖插入雄成虫胸腹结合处,轻轻取下虫体下腹部,浸泡在10%NaOH溶液中,放于100℃的水浴锅中煮1 min,直至肉眼可见仅剩明显骨化部分(肌肉溶解);取出虫体用超纯水清洗5～6次,用吸水纸吸干多余水分,置于凹面载玻片事先滴好的灭菌甘油中,在体视显微镜下进行观察解剖和鉴定,最后使用显微镜和显微镜摄像机拍照保存,根据相关资料进行种类鉴定。

1.4 分子鉴定

1.4.1叶蝉总 DNA 提取和PCR 扩增

小绿叶蝉的总DNA使用 Omega 公司的微量 DNA 提取试剂盒按照说明书方法提取,最后的总DNA于-20℃冰箱中保存备用。PCR通用引物COIF和COIR参照 Folmer 等[12]设计,由昆明擎科生物技术有限公司合成,(COIF:GGTCAACAAATCATAAAGATATTG，COIR:TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAT)。扩增体系为2×TransStart®Max Buffer(2 mmol/L)12.5 μL,dNTP Mix(10 mmol/L)0.5 μL,Phanta®Max DNA Polymerase 0.5 μL,上游引物(10 μmol/L)1 μL,下游引物(10 μmol/L)1 μL,昆虫总 DNA 模板 1 μL,加ddH2O 至25 μL。PCR反应条件为: 94℃ 5 min;94℃ 30 s,46℃ 30 s,72℃ 46 s,35个循环;72℃延伸 10 min。PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4.2克隆及测序

目标产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后与全式金克隆载体 pEASY®-Blunt Simple Cloning Vector 进行连接并转化到大肠杆菌 Trans1-T1 Phage Resistant 中,经蓝白斑筛选阳性克隆子后,接种到含氨苄青霉素(ampicillin, Amp)的LB液体培养基中培养6 h并进行菌液 PCR 检测后送至北京擎科生物公司进行双向测序。

1.4.3COⅠ 基因序列比较分析

应用DNAMANV7软件,对拟帕小绿叶蝉Empoasca(Matsumurasca)paraparvipenis-CA的COⅠ 基因序列进行多序列比对,去除相同的上下游引物部分,得到 709 bpCOⅠ 基因序列。将序列输入 NCBI 网站,进行 BLAST 相似性检索,显示与基因库中现有昆虫COⅠ 基因序列具有很高的同源性,可知所测序列为COⅠ 基因。后使用DNAMA NV7软件计算基因序列片段中各碱基的平均含量、变异位点、简约信息位点等。最后将拟帕小绿叶蝉COⅠ 序列与 GenBank 中搜索的 12种叶蝉(小绿叶蝉族Empoascini的小绿叶蝉属Empoasca5种、芒果叶蝉属Amrasca1种、奥小叶蝉属Austroasca1种,叉脉叶蝉族 Dikraneurini 1种,斑叶蝉族Erythroneurini 1种,塔叶蝉族 Zyginellini 1种,眼小叶蝉族 Alebrini 1种,小叶蝉族 Typhlocybini 1种)共22个COⅠ 序列进行多重比对,利用软件自动删除非对齐序列辅以手动矫正,保存Fasta格式。用 MEGA7.0打开Fasta 格式,利用Kimura 2-parameter 模型计算出平均遗传距离,并采用自举检验(Bootstrap)1 000次进行进化树检验,以叉脉叶蝉族 Dikraneurini等5个族的COⅠ基因序列为外群,构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 拟帕小绿叶蝉形态特征鉴定

2.1.1拟帕小绿叶蝉卵及若虫特征

拟帕小绿叶蝉卵长0.8～0.9 mm,表面光滑,香蕉形,上细下粗,中部微弯,初产时为白色透明状(图1a1),后逐渐变为黄绿色(图1a2),孵化前可见暗红色小眼点(图1a3)。卵散产于嫩茎、叶柄、叶脉等组织内,以顶芽下第2与第3叶之间的茎内最多。

拟帕小绿叶蝉若虫期共5龄,根据虫体大小、颜色、翅芽有无及长度来区分。1龄若虫体长0.8～0.9 mm,体乳白色,头大,身体细小,复眼红色,刚毛状触角细,体被稀疏黑色细毛(图1b);2龄若虫体长0.9～1.1 mm,体淡黄至黄绿色,复眼灰白色,体分节较明显,体被稀疏黑色细毛,翅芽超过第1腹节(图1c);3龄若虫体长1.5～1.8 mm,体淡绿色,复眼灰白色;腹部明显增大,翅芽超过第3腹节(图1d);4龄若虫体长1.8～2.0 mm,体淡绿色,翅芽逐渐明显,超过第4腹节(图1e);5龄若虫体长2.0～2.2 mm,体色黄绿,翅芽伸达第5腹节,第4腹节明显膨大(图1f)。

2.1.2拟帕小绿叶蝉雌雄成虫形态特征

拟帕小绿叶蝉成虫体长3.0～3.8 mm,体淡绿色或黄绿色,刺吸式口器,触角3节, 刚毛状(图1h、j)。头冠表面光滑,无浅凹陷,前端钝角凸出, 缘圆微尖,头冠处具一条明显的冠缝,伸达头冠前缘,约占头冠长度的2/3,头冠前缘具1对淡绿色单眼,复眼灰褐至深褐色,不伸达前胸背板中部(图1j,图3b);前胸背板淡灰绿色,有深色斑点,不向后延伸盖住小盾片,中胸小盾片上有特殊的淡白色斑点,中后部的盾间沟,不伸达侧缘(图1h、i,图3a)。足淡绿色,两边各具一排大刺,爪褐色,跗节3节。拟帕小绿叶蝉雌雄异型, 除体型上雌成虫较大、颜色较深外,雌雄成虫最大的区别在虫体腹部末端:雌成虫背腹产卵瓣于尾节处嵌合,产卵瓣条缝处具褐色针状产卵器(图1g);雄成虫腹部末端退化为三角形的尾节侧瓣,其端部具上下生殖板,弯向背部,外缘着生许多大刚毛,内缘具成列小刚毛(图1g)。卵和各龄期若虫以及雌雄成虫与孟召娜等[3]报道的小贯小绿叶蝉Empoascaonukii体色、体型及大小十分相似,外形上并无差别。

图1 拟帕小绿叶蝉各龄期形态特征

有翅2对,前、后翅膜质(图2,图3e、f);前翅淡绿色, 基部颜色较深, 翅端烟褐色,超出身体末端;革片有R、MP、CuA 3条纵脉,均不分支,在翅端1/3处由4条端横脉cv、MP″、CuA′、ScP+RA划分翅端,形成4个封闭的小室,除端横脉外无其他横脉,端横脉不处于同一水平处,端区有3条端纵脉:RP、MP′、MP″ +CuA′,RP与MP′脉基部分离(图2,图3e); 后翅大而透明,MP和R脉端部愈合,ScP+RA 脉退化,后翅CuA脉端部不分叉(图2,图3f)。

图2 拟帕小绿叶蝉雄成虫前后翅

图3 拟帕小绿叶蝉雄成虫分类特征

2.1.3拟帕小绿叶蝉雄成虫腹部及外生殖器解剖特征

拟帕小绿叶蝉雄成虫腹突发达,于腹腔内平行向后延伸,伸达第6腹节(图3d, 4d);尾节背板和侧板愈合,侧板向后延伸成尾节侧瓣,侧面观呈三角形,边缘整齐着生11～14根刚毛(图3i, 4i);尾节侧瓣后缘突出,形成尾节突,尾节突狭窄略弯曲,长度超过尾节侧瓣(图3l, 4l);尾节腹部具1对分离的下生殖板,侧面观端部钝圆,中部较狭窄,向体后方延伸,超过尾节侧瓣,外缘着生许多大刚毛,内缘具成列小刚毛(图3j, 4j);生殖腔内肛突发达,端部尖锐,中间两处凹陷,上具不规则瘤突,伸达尾节腹部(图3h, 4h);连索基部宽阔,端部中部微微向内凹陷,与阳茎分离(图3g, 4g);生殖腔中央的阳茎端部侧观狭窄,腹面观中部阔,两端收狭,阳茎顶端具一对细长突起,阳茎膨大的基部具另一对细长突起,突起端部均不分叉,阳茎口位于阳茎端部,近顶生(图3m、n, 4m、n);阳基侧突基部阔,端半部变狭长,近端部有细刚毛,端部有4个锯齿突(图3k, 4k);肛突短阔,侧观略波形弯曲,具3个瘤突,端部不尖锐(图3h, 4h)。形态鉴定结果与外生殖器解剖结果与Zhang等[4]前期鉴定的拟帕小绿叶蝉Empoasca(Matsumurasca)paraparvipenis相吻合。根据文献资料和解剖观察喜树上小绿叶蝉雄虫外生殖器，根据前人关于拟帕小绿叶蝉外生殖器描述进行手绘，仅供参考(图3)。但根据相关文献报道，拟帕小绿叶蝉能取食茶树等许多植株，通过多种植物叶蝉取食试验，相关数据表明喜树上小绿叶蝉只取食喜树，因此推测该叶蝉可能是喜树上一种专食性害虫，要明确其分类地位还需对其进行分子鉴定。

图4 拟帕小绿叶蝉雄虫下腹部形态

2.2 拟帕小绿叶蝉分子鉴定

2.2.1COⅠ基因序列组成及种群间遗传距离比较分析

本试验进行了拟帕小绿叶蝉COⅠ片段的PCR扩增,电泳结果显示得到约760 bp的PCR扩增产物(图5)。将自测的拟帕小绿叶蝉COⅠ序列与GenBank中检索的12种叶蝉22条COⅠ序列进行多重比对,非对齐序列剪切后的709 bp片段的分析结果显示,该基因序列有保守位点228个,变异位点479个,占总位点的67.4%;简约信息位点384个,占总位点的54.0%,占变异位点的80.1%;95个自裔位点,占总位点的13.3%。A、T、C、G含量分别为25.6%,43.9%,14.4%,16.0%,A+T的平均含量为69.5%,G+C的平均含量为30.5%,明显存在A+T 含量偏向性,是典型的昆虫线粒体 DNACOⅠ 序列碱基组成。

图5 拟帕小绿叶蝉COⅠ基因琼脂糖凝胶电泳图

基于 Kimura 2-parameter 模型计算出两两序列之间的平均遗传距离。计算结果显示同是小绿叶蝉族的11种小绿叶蝉遗传距离(TV+TS)(即d值)较小,为 0.18～3.14(d<4),其中Empoascadecipiens的一个地方亚种(isolate 2v,HM189292)与拟帕小绿叶蝉遗传距离最小,为0.18,其次为小贯小绿叶蝉Empoasca(Matsumurasca)onukii(voucher CBY1,MH631465)和木瓜小绿叶蝉Empoascapapayae(isolate EpT,KY931024),遗传距离分别为0.21、1.70,与同族不同属的芒果叶蝉属AmrascaGhauri的Amrascabiguttula和奥小叶蝉属AustroascaLower的A.viridigrisea(KF226775)遗传距离分别为3.14、3.05。而拟帕小绿叶蝉与外群的叉脉叶蝉族 Dikraneurini、斑叶蝉族Erythroneurini、塔叶蝉族 Zyginellini、眼小叶蝉族 Alebrini和小叶蝉族 Typhlocybini的遗传距离除两个特殊的叶蝉外,d值均大于4,且眼小叶蝉族>小叶蝉族>叉脉叶蝉族>斑叶蝉族,明显大于其族内遗传距离(表 1)。

2.2.2系统发育树构建及分析

用 MEGA7.0,采用最大似然法构建ML基因进化树。从拟帕小绿叶蝉和近缘种外群叶蝉的系统进化树(图6)可以看出,所有叶蝉科样本分为2个大支,除小绿叶蝉族 Empoascini外,叉脉叶蝉族 Dikraneurini和小叶蝉族 Typhlocybini等5个族聚成1个稳定进化支作为外群,拟帕小绿叶蝉Empoascaparaparvipenis、小贯小绿叶蝉Empoascaonukii、Empoascadecipiens、木瓜小绿叶蝉Empoascapapayae[5]等9个种类的叶蝉聚成一个进化支,又分开成为明显的2个进化亚支,拟帕小绿叶蝉Empoascaparaparvipenis与小贯小绿叶蝉Empoascaonukii(voucher CBY1)的一个地方种以较高的置信度先分化出来,相聚到同一个进化亚支下,后与其他同属的木瓜小绿叶蝉Empoascapapayae、Empoascadecipiens等聚为一支。

图6 基于叶蝉COⅠ基因片段构建的ML系统进化树

形态学上解剖后通过对照小绿叶蝉族分属检索表[6],拟帕小绿叶蝉体纤弱,头冠前端钝圆突出,冠缝明显,未达头冠前缘,单眼位于头冠与颜面交界处, 颜面宽阔, 宽度略小于中长, 额唇基区隆起; 胸长大于头长;前翅 RP、MP′脉共柄, 后翅 CuA 端部不分叉;腹突发达, 有尾节突;下生殖板具大刚毛, 大刚毛列外侧常具细刚毛;阳基侧突长, 近端部有细刚毛, 端部有锯齿突;阳茎前腔较发达;肛突侧观明显等特点将其归属于小绿叶蝉属EmpoascaWalsh。再对照小绿叶蝉属亚属检索表[5]来看,拟帕小绿叶蝉前翅RP、MP′脉基部起自一点,且具一对明显的腹突,应将其归属于松村叶蝉亚属Empoasca(Matsumurasca)Anufnev。分子上结合表1各物种之间的遗传距离,说明拟帕小绿叶蝉与小贯小绿叶蝉的遗传关系很近,但是它们之间遗传距离大于2%的物种界限,并不是一个种。再从系统发育树来看,小贯小绿叶蝉Empoasca(Matsumurasca)onukii(voucher CBY1)和Empoascadecipiens(isolate 2v)都与拟帕小绿叶蝉Empoascaparaparvipenis亲缘关系很近,而小贯小绿叶蝉属于松村叶蝉亚属Empoasca(Matsumurasca)Anufriev,Empoascadecipiens属于小绿叶蝉属,但亚属不明确。形态解剖和COⅠ序列对拟帕小绿叶蝉的分类地位一致,因此确定拟帕小绿叶蝉属于松村叶蝉亚属Empoasca(Matsumurasca)Anufriev。

3 结论与讨论

小绿叶蝉种类繁多,寄主范围广,分布地域辽阔,除了对植物的直接取食为害,还传播病毒和植原体等引起病害,对农林牧业造成巨大的经济损失[7]。1985年赵建华等就报道了喜树丛枝病是由一种类菌原体(植原体)引起。1990年张务民等报道了为害喜树的几种叶蝉,其中就有小绿叶蝉[8],但后期对于喜树病虫害的研究越来越少,直到2006年贵州大学的龙同等因为喜树上小绿叶蝉为害严重,对其进行了生物学、生态学及防治研究[9],但对于该种具体分类地位并未明确,一直以喜树小绿叶蝉为名。后由Zhang等[4]通过形态学鉴定后将其暂命名为Empoasca(Empoasca)paraparvipenis(拟帕小绿叶蝉)。

本研究通过形态学和分子鉴定确定了喜树丛枝植原体主要传播媒介是小绿叶蝉属Empoasca松村叶蝉亚属Empoasca(Matsumurasca)Anufriev的拟帕小绿叶蝉Empoasca(Matsumurasca)paraparvipenisZhangetLiu-CA,除外生殖器上阳茎无突起,肛突端部弧形弯曲,略收狭,末端不尖锐外,各龄期及雌雄成虫的形态及外生殖器解剖结果与小贯小绿叶蝉Empoasca(Matsumurasca)onukii十分相似,说明拟帕小绿叶蝉与小贯小绿叶蝉亲缘关系很近。通过COⅠ基因的扩增和构建系统进化树,拟帕小绿叶蝉与小贯小绿叶蝉以较高的置信度首先分化出来聚为一支,遗传距离结果也表明拟帕小绿叶蝉与小贯小绿叶蝉亲缘关系十分接近,但d值大于2%的物种距离,因此拟帕小绿叶蝉应该是单独的一个种,与Zhang等[4]鉴定的结果一致,由于本文所用拟帕小绿叶蝉采集地点在云南文山,又通过取食试验验证了从文山捕捉的拟帕小绿叶蝉不会取食茶树,因此可能是由于地理隔离,而进化成了另一个地方亚种,因此将其命名为EmpoascaparaparvipenisZhangetLiu-CA。

分析拟帕小绿叶蝉COⅠ基因序列,该基因序列A+T的平均含量为69.5%,G+C的平均含量为30.5%,明显存在A+T含量偏向性。该基因序列保守位点228个,变异位点479个,占总位点的67.4%;简约信息位点384个,占总位点的54.0%,占变异位点的80.1%;95个自裔位点,占总位点的13.3%。说明COⅠ基因能够为小绿叶蝉系统发育关系提供足够的信息简约位点,这与肖金花的结论相吻合[10]。COⅠ基因序列不仅可用来研究科内或属内种群的系统发育问题[11],且对于同属的种间甚至地方亚种间的系统发育问题也可以有很准确的分析。

从本次研究可看出,同属内不同种间遗传距离最小,通过拟帕小绿叶蝉Empoasca(Matsumurasca)paraparvipenisZhangetLiu-CA和Empoascadecipiens(isolate 2v)的遗传距离来看,同属不同种的遗传距离d<1;同属不同亚属间的遗传距离14;但往往由于长期地理隔离,同属内不同种,或者同族内不同属会形成较远的亲缘关系,如本文中长绿叶蝉亚属Empoasca(Kybos)Fieber的黄褐长绿叶蝉Empoasca(Kybos)purus与同族的亲缘关系都很远,却与小叶蝉族的Typhlocybamodesta遗传距离十分近,斑叶蝉族Erythroneurini的Erythroneuratricincta和塔叶蝉族 Zyginellini 的Zyginellaminuta与小绿叶蝉族的拟帕小绿叶蝉的遗传距离也很近,而与同族的较远,这与刘雲祥的地理隔离和寄主转变对昆虫的表型和遗传分化具有重要影响的结论一致[12]。

经过前期试验以及文献报道发现喜树似乎是拟帕小绿叶蝉的专性寄主,取食寄主的专化性是否与拟帕小绿叶蝉与小贯小绿叶蝉的系统进化有关,还有待深入研究。昆虫的系统进化往往与其长期所处的环境和食物密切相关,相似的地理环境和食物可能会导致其外部形态十分相似,肉眼难以辨认[13]。随着分子生物技术的飞速发展,利用分子技术鉴定昆虫种类已经越来越普遍,但因为分子试验人为因素较大,要准确鉴定新的昆虫种类以及明确其分类地位,还需传统的形态学和分子方法相结合进行鉴定,先通过外部形态观察,大体定位其科属,再利用分子学方法建立系统进化树,分析大概的亲缘关系,再根据亲缘关系进行雄性外生殖器的解剖,最后综合解剖结果对照种属检索表确定其分类地位。