养虾池中1株副溶血弧菌的分离和鉴定

崔玮琪

(滨州市海洋发展研究院，山东滨州 256600)

弧菌(Vibrio)是海水养殖中比较常见的致病菌之一，发病率高，危害性较大，尤其是对虾育苗期，感染后会出现大量死亡的现象[1，2]。有研究发现，副溶血性弧菌是导致对虾急性肝胰腺坏死病(Ahpnd)的主要病原体，被感染后的对虾会出现生长缓慢、运动无力、中肠及肝胰腺苍腺苍白等症状[3-6]，因此弧菌严重制约这对虾产业的发展。文章从患病的凡纳滨对虾养殖池的水样中分离出病原菌株并对菌株进行鉴定，以期为对虾养殖中疫病防控研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验水样

试验水样来自滨州市博兴县某育苗厂的4个健康无病害的凡纳滨对虾的养殖池，每个池塘内选取了5个不同采样点，每个采样点取20mL水样，将所有水样混合均匀。

1.2 菌株分离、纯化

1.2.1 初筛

在超净工作台内，取混合后的水样100uL均匀涂布于TCBS固体琼脂培养基上，28℃倒置培养24 hrs[7]，观察菌落形态。将培养出的细菌进行划线纯化，再挑取单菌落接种到TSB培养基，过夜培养[8]。

1.2.2 菌株的生理生化鉴定

形态特征：挑取TCBS培养基上的蓝绿色单菌落进行革兰氏染色，在显微镜下观察其形态特征。

生化鉴定：主要包括葡萄糖发酵、甘露醇发酵、蔗糖发酵、阿拉伯糖发酵、鼠李糖发酵、4℃生长、42℃生长、氧化酶、蔗糖发酵、接触酶、葡萄糖产气、0% NaCl生长、2%NaCl生长、5%NaCl生长、7% NaCl生长、10% NaCl生长、吲哚产生、V.P.反应、甲基红。

参照《常见细菌鉴定手册》[9]和《伯杰氏鉴定细菌手册》判断细菌种类。

1.2.3 16S rDNA基因序列分析

采用TaKaRa试剂公司的DNA提取试剂盒提取单组菌落DNA，将提取得到的DNA进行PCR扩增。PCR扩增反应条件：95℃时5mins，94℃时1min，55℃时1min，72℃时90s。总计进行35个循环，最后72℃时10mins。产物经1%琼脂凝胶电泳检测后，送至生工生物工程(济南)股份有限公司测序。应用BLAST软件将所得到的序列与GenBank中有关序列进行同源性分析，选取同源性高的序列，利用Mega 5.0软件构建系统发育树。

1.2.4 生长曲线的测定

将筛选得到的菌种进行37℃液体摇床培养，从接种开始每隔2hrs取样一次，在560nm下测定菌液的OD值。绘制OD值和培养时间的关系图。

2 浸染试验

2.1 攻毒实验对象及条件

采用滨州市某养殖场体长约3cm左右的健康的凡纳滨为试验对象，正式试验开始前，将凡纳滨对虾放在pH8.0，连续充气塑料桶内暂养4d，配合饲料饱食投喂。养殖水体盐度为19‰，水温为26℃，随后将凡纳滨对虾随机分组，每组为30尾。在浸染试验前所有试验组对虾需禁食1d。

2.2 供试菌株

将纯化后的菌株接种到2216E液体培养基上，28℃摇床培养20hrs，560nm(OD 560nm)比浊测定后备用。

2.3 浸浴攻毒实验

试验共设立5个处理组和一个对照组。将活化的ZH-1菌液 [104cfu/mL、105cfu/mL、106cfu/mL、107cfu/mL和108cfu/mL] 300mL分别加入20L的水体中，浸泡30尾试验的凡纳滨对虾，同时设同体积的无菌生理盐水作为实验对照，每组设置3个平行。每天观察凡纳滨对虾的发病与死亡情况，实验周期为7d。

3 实验结果

3.1 病原菌的分离

从来自不同苗池的3株菌株，选择其中1株进行后续试验，编号为ZH-1。

3.2 病原菌的鉴定

3.2.1 镜检

ZH-1经革兰氏染色镜检观察为阴性菌，形状为短杆状、两端钝圆，分散排列，边缘圆形，略微隆起，浑浊，呈绿色，在2216E培养基上菌落呈扩展状，大小不规则，不透明，湿润，浅绿色。

3.2.2 生化试验

对分离株做生化试验结果如表1所示。

表1 ZH-1的生理生化特征Table1 Physiological and biochemical characterization of ZH-1 strain

3.3 16S rDNA测定

采用16S rDNA测定后，获得图1结果：

图1 病原菌16S rDNA基因序列

图2 基于16S rDNA基因构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

3.4 分离株生长曲线的测定

如图3所示，菌株ZH-1在培养6hrs的时候开始进入了对数生长期，在22hrs时达到了对数期的最高值，随后进入了稳定期，28hrs后开始进入衰亡期。

图3 ZH-1的生长曲线Fig.3 the growth curve of ZH-1

3.5 凡纳滨对虾浸染攻毒试验结果

取健康的凡纳滨对虾，验证菌株ZH-1的致病性。试验结果表明：浓度分别为1.0×104cfu/mL、1.0×105cfu/mL、1.0×106cfu/mL、1.0×107cfu/mL、1.0×108cfu/mL时，浸浴4d后死亡率分别为100%、76.7%、40.0%、6.67%，而对照组没有出现死亡现象。经过计算菌株ZH-1对凡纳滨对虾的半数致死浓度为1.12×106cfu/mL。

表2 菌株ZH-1对凡纳滨对虾人工浸浴感染半致死试验Tab.2 LC50 test of pathogenic strian ZH-1 against Litopenaeus vannamei

4 讨论

副溶血弧菌是水产养殖病害的主要病原菌，是急性肝胰腺坏死病的主要病原体，感染后的对虾会出现生长缓慢、乏力、肝胰腺及肠发白等症状[4，5，9]。樊景凤、张晓君等报道过凡纳滨对虾被副溶血弧菌感染后会出现红体的现象，该研究中使用菌株ZH-1感染凡纳滨对虾后不仅出现附肢发红，肝胰腺出现肿大。人工浸浴感染实验证明菌株ZH-1感染性较强，菌株浓度在1.0×107cfu/mL时会造成76.7%的对虾死亡。

近年来，弧菌作为对凡纳滨对虾养殖场的危害出现了逐年严重的趋势，因此养殖户要引起足够的重视，提高防控意识。一要保证做每次进水需要消毒，为对虾生长提供良好的水环境；二要做到及时跟踪监测养殖池内的水质环境，防止弧菌的大量繁殖和传播；三要定时监测水体和虾体内弧菌情况；三是可以投喂一些益生菌，例如乳酸菌、酵母菌等，在肠道内形成优势菌群，抑制肠道内弧菌的繁殖。