浓香型白酒窖泥微生物群落及其风味成分研究进展

胡世伟，王超凡，王景春，王慧慧，赵 华，张朝正*

（天津科技大学 生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室 天津市工业微生物重点实验室，天津 300457）

白酒作为世界六大蒸馏酒，因其独特的口感和香味，深受世界各国人民喜爱。浓香型白酒的生产过程一般包括制曲、发酵、蒸馏、勾调等步骤[1]。发酵过程中的微生物代谢产生的香气化合物，是决定浓香型白酒风味的重要因素之一。窖泥是在窖池内壁附着的一层黏土，参与白酒的发酵过程，是浓香型白酒特征风味物质己酸乙酯的来源地。老窖中的窖泥保障了传统品牌白酒的风味和品质，窖泥中产生的乙酸、丁酸、己酸等物质及其和乙醇形成的多种乙酯，通过物质交换转移到酒醅中，再通过蒸馏进入白酒中，进一步影响浓香型白酒的风味和品质[2]。在浓香型白酒的整个酿造过程中，窖泥是产生酒体风味物质的重要的场所，对浓香型白酒的特色和品质具有决定性作用[3]。但由于窖泥的特殊性，限制了一些常规微生物分析技术的应用，致使窖泥的研究处于瓶颈阶段，但一些组学技术的发展，如宏基因组学和元转录组学、代谢组学等对窖泥的研究提供了新的检测手段。

当谈论不同地区的白酒风味特点时，可以归结于多方面因素的综合作用。其中，生产工艺、原材料的不同以及微生物群落的差异，是导致这种多样性的关键因素。在这些因素中，窖泥和酒曲起着重要作用，特别是在影响浓香型白酒风味方面，窖泥的影响尤为显著。窖泥和酒曲不仅仅是白酒酿造过程中的材料，更代表着酿酒工匠多年的经验和技艺积累。尤其是历经岁月的窖泥，蕴含了丰富的酿酒智慧。这其中蕴含的微生物群落，也扮演着非常重要且独特的角色[4]。窖泥中的微生物如己酸菌和乳酸菌产生的酶类在酒醅中参与白酒生产过程中的多种反应，产生多种化合物。窖泥中微生物的代谢产物和分解产物中也包含多种挥发性化合物，这些化合物包括酸类、酯类、酮类、醇类等，贡献了白酒特有的香气和风味，如果香、花香、香草香气等[5]，赋予了白酒丰富的口感和复杂性。因此研究窖泥中微生物群落对提高白酒品质非常重要。

鉴于窖泥在浓香型白酒生产过程中的关键作用，本文简述了窖泥微生物中的乳酸菌、己酸菌、芽孢杆菌及产甲烷菌，并综述了浓香型白酒中的风味物质，探讨了窖泥中的微生物菌群对浓香型白酒挥发性风味物质的影响，旨在为进一步研究浓香型白酒的窖泥微生物、提升白酒质量以及增强风味特性提供思路和支持。

1 窖泥中的微生物

1.1 乳酸菌

乳酸菌是自然界中广泛存在的一类细菌，目前已经鉴定出的乳酸菌属种达到了23种[6]。同时，从窖泥等环境中也可以分离出多种乳酸菌，其属种达到16个左右[7]。研究发现，酒醅中的乳酸菌和窖泥中的乳酸菌在氧的利用、移动元件含量和氧化胁迫耐受方面存在差异，且窖泥中兼性厌氧乳酸菌的丰度高于酒醅[8]。这几年来，窖泥中乳酸菌的分离培养和代谢研究都取得了重大进展，发现乳杆菌属（Lactobacillus）、乳球菌属（Lactococcus）在窖泥中丰度最高[9]。由于乳酸菌的代谢特点，其所产生的乳酸和乙酸在浓香型白酒的风味及窖泥环境中具有重要作用。

乳酸是浓香型白酒中的一个重要有机酸，在窖池中的存在对窖泥的pH值影响较大，从而维持了适宜的酸性环境[10]。这种酸性环境不仅有助于淀粉的糖化过程，还能促进乙醇的发酵。此外，乳酸还具备一定的抑制细菌生长的功能，对维持酿酒过程的正常进行也起到了一定的作用[11]。张会敏等[12]研究确认了窖泥中乳酸含量与pH值之间存在着密切的相关性。通过比较新旧窖泥中总氢含量的差异，并探究这些差异与pH值及乳酸含量之间的关系，可以更深入地了解窖泥微生物群落的代谢情况与窖泥质量之间的关联。

1.2 己酸菌

己酸菌隶属梭菌科，广泛存在于窖泥中。有研究表明[12]，己酸菌在某些窖泥样本中是主要的优势菌，对浓香型白酒风味的生成有着重要的作用。己酸菌在改良肉汤培养基中发酵后能得到乙酸、丁酸和己酸等多种酸[13]。GAO Z Z等[14]研究表明，己酸菌是窖泥和黄水中的重要微生物，与己酸的产生存在着重要的关联。乙酸、丁酸和己酸是浓香型白酒中常见的酸性香气物质，其在发酵过程中可以与酒中的醇类反应生成相应的酯类化合物，从而形成香气物质。这些酯类物质通常具有芳香或果香味道，是浓香型白酒中重要的香气成分之一。乙酸、丁酸和己酸是赋予浓香型白酒独特香气的重要元素，它们也是相关酯形成的关键成分。韩珍琼等[15]研究发现，己酸菌在白酒生产过程中产生的己酸，不仅仅有着赋予香气、增强香味、减少刺激性的作用，同时还能与酵母发酵产生的酒精发生化学反应，形成一种称为己酸乙酯的化合物。这种化合物是浓香型白酒独特的主要香味成分之一。通过这种反应，能够改善浓香型白酒的风味和口感。实际上，这个过程影响着浓香型白酒的风格和质量。胡承等[16]研究表明，窖泥的微生物群落主要是由厌氧异养菌和己酸菌等微生物构成的，在酶的作用下，发生多种生化反应，产生代谢产物，进而生成浓香型白酒的呈香物质。近年来，随着气质联用技术的不断发展，窖泥中风味物质的分析也迈上了新的台阶。鲁少文等[17]通过富集培养新型瘤胃梭菌（Clostridiumsp.）CPC-11并将其用于窖泥的养护中，使浓香型白酒的主要风味物质（如己酸和己酸乙酯）在窖泥中积聚，从而增强窖泥品质，提高白酒风味质量。

1.3 芽孢杆菌

芽孢杆菌属（Bacillus）是广泛分布于自然环境中的微生物，这类微生物在食品的发酵过程中，会产生各种风味化合物。在自然条件下，浓香型白酒的发酵也常常会涉及到芽孢杆菌的作用[18]。事实上，窖泥中的芽孢杆菌也是浓香型白酒酿造的重要组成部分，从窖泥中分离得到了短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、耐硼赖氨酸芽孢杆菌（Bacillus boronophilus）等芽孢杆菌属中的物种[15]。它们都能够代谢产生3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇等浓香型白酒重要的香味物质，对于浓香型白酒的风味特征起到一定的调节作用[19]。因此，研究窖泥中芽孢杆菌属的分布、代谢规律及其与白酒风味之间的关联，对于提高浓香型白酒生产技术和品质具有重要的意义。众多研究结果表明，芽孢杆菌对浓香型白酒风味物质的产生起着重要作用，并且芽孢杆菌的次级代谢产物与窖泥中众多物质相互作用和反应，维持着窖泥稳定的酸碱度环境，并且芽孢杆菌的稳定生长可促使产甲烷菌（Methanogenic archaea）的生成[20]。刘燕梅等[19]从浓香型白酒的窖泥中分离出三种细菌，利用磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid analysis，PLFA）鉴定方法确认它们分别是球形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaerieus）、短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）和尘埃类芽孢杆菌（Paenibacillus larvaesubsup.pulvifaciens）。研究发现，这三种细菌具备强大的产生风味物质能力，而且它们所合成的化合物种类繁多，主要包括高级醇、高级酮等芳香类化合物。这些微量成分在浓香型白酒中的存在起到了关键作用，它们不仅能够贡献香气，还能在风味方面提供协同效应，丰富白酒的口感和氛围。因此，这些细菌产生的化合物在塑造浓香型白酒独特风味特征方面具有重要的放香、增香和调香功能。多项研究结果均显示，芽孢杆菌在浓香型白酒的香气成分中扮演着重要角色，其次级代谢产物可能与其他窖泥微生物相互影响，从而维持了窖泥环境的稳定状态。这意味着芽孢杆菌不仅在香味方面对白酒贡献巨大，同时也在维护窖泥生态平衡方面具有重要作用。侯小歌等[21]研究发现，乳酸、丁酸、己酸等香味物质会在梭状芽孢杆菌、乳酸片球菌等细菌的代谢过程中产生，并且会影响浓香型白酒风味和品质的形成。

1.4 产甲烷菌

产甲烷菌是在厌氧条件下产生的，它产生的一些重要产物是浓香型白酒的重要香味成分。窖泥中有着丰富的产甲烷菌，这些产甲烷菌维持着窖泥的酸碱平衡以及整个厌氧消化体系的稳定[22]。窖泥中主要的产甲烷菌为甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）、甲烷囊菌属（Methanoculleus）、甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）和甲烷杆菌属（Methanobacterium）。这些甲烷产生菌能有效地利用发酵型细菌产生的氢气，将其转化为甲烷，从而防止氢气在环境中积累，同时还抑制了脂肪酸的分解。由于这些甲烷产生菌在窖泥中调节了氢气和乙酸的平衡，它们促进了浓香型白酒中香味成分的生成[23]。产甲烷菌在窖泥中可以使酸性消化阶段的代谢产物进一步分解，使酸碱度上升，并且甲烷菌能氧化分子状态的氢，利用二氧化碳作为电子受体[24]。

研究表明，可以通过互营细菌和产甲烷菌互营合作实现对脂肪酸的降解[25]。窖泥中含有丰富的产甲烷菌，而且窖泥中的产甲烷菌与多数细菌呈正相关[26]。在浓香型白酒的发酵过程中，甲烷杆菌属是窖池中古菌群中数量最多的一类。研究显示，窖泥中的甲烷杆菌属与氢孢菌属以及产己酸菌属之间存在着正向关联，它们之间相互影响[27]。通过在窖泥中发现的各种短链脂肪酸的合成基因，得到了产甲烷菌与其他微生物相互作用的强有力证据。

2 浓香型白酒中的风味物质

2.1 酯类物质

浓香型白酒的主要风味成分之一是己酸乙酯，其含量在评价白酒的质量上具有重要作用。此外，丁酸乙酯、戊酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、2-羟基丙酸乙酯以及棕榈酸乙酯等酯类化合物，在白酒的化学成分中所占比例较高，被认为是白酒主要的香味成分[28-29]。FAN W L等[30]通过气相色谱-嗅闻（gas chromatography-olfactory，GC-O）技术分析和香气萃取稀释分析（aromaextractdilutionanalysis，AEDA）发现，剑南春和五粮液这两种浓香型白酒中含有一系列重要的香气化合物。其中，丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、己酸丁酯、3-甲基丁酸乙酯以及己酸等酯类化合物被认定为主要的香气成分。在这些化合物中，酯类，尤其是乙酯，被认为是这些浓香型白酒中最重要的芳香物质。特香型白酒的独特特征之一是其含有丙酸乙酯[31]，这种化合物的味道微涩，有芝麻和菠萝的香气[32]。研究发现[33]，通过引入企业自制富含营养的酒窖泥，可以增加特香型白酒基础酒中丙酸乙酯的浓度，从而赋予酒品更加独特的风味。另一方面，在浓香型白酒中，己酸乙酯是主要的芳香化合物之一，在白酒的微生物发酵过程中，酯类的合成是一个重要步骤，主要是通过酸与醇在酯化酶的催化作用下形成的。因此，能够赋予白酒独特香气的微生物包括两类：一类是能够产生香气分子及其前体的微生物，另一类是具备酯化酶活性的微生物，其量的变化对于浓香型白酒的品质具有至关重要的影响[21]。此外，辛酸乙酯的香气强度仅次于己酸乙酯，研究表明，微量添加辛酸乙酯到浓香型白酒中，可以赋予酒液明显的水果香气；适度的辛酸乙酯含量有助于增强酒体的复合香气，起到积极的促进作用，然而，当辛酸乙酯含量过多时，会对酒体中其他香味成分产生抑制效应，在浓香型白酒的风味中也扮演着重要的角色[34]。这些香气成分在白酒的制作过程中发挥着重要作用，对于不同类型的白酒风味贡献独特的特点。

2.2 酸类物质

己酸、乙酸和丁酸是浓香型白酒中的三种重要有机酸，它们为白酒带来了愉悦的香气，因其在原酒中的含量较高。酒中适度的酸味能够使白酒口感更加丰富，而酸味不足则可能导致白酒口味单调。这些酸类物质在白酒中还具有另一个重要的作用，就是作为挥发性香味物质酯类的合成前体。它们通过与醇类反应，在酵母和微生物的作用下生成各种香味丰富的酯类化合物[35]。其中，己酸具有增强香气、助于形成香气、减轻酒体的刺激感，并在口感上产生缓冲平衡的作用。此外，己酸还是浓香型白酒的主要香气成分之一，己酸乙酯的前体[36-37]。杜相林[38]研究对比了新老窖泥制作的白酒，分析了原酒中上、中、下三个糟层的五种主要挥发性酸类物质。结果表明，在这两种窖泥酒体中，酸类物质的含量从高到低依次是乙酸、己酸、丁酸、戊酸和庚酸。综合而言，新窖泥酒体相对于老窖泥酒体，其乙酸和己酸的总含量较高。张建敏等[39]研究显示，适度的酸度可以调整白酒的风格，提升其口感和适口性。

2.3 醇类物质

醇类化合物在白酒中具有醇甜的风味特点，并能够起到助香的作用，对于白酒的风味形成和酒体的丰满浓厚具有重要作用。这些醇类化合物可以与窖泥中的微生物产生的酯化酶一同作用，与酸类物质共同生成酯类化合物。醇类不仅仅赋予酒香和味道，同时也是醇甜和助香特点的主要来源，对于形成白酒的风味以及增进酒体的丰满和浓郁具有关键影响[40]。段明松等[41]研究表明，对新旧窖泥制作的白酒，取其上、中、下三个糟层的原酒中的8种主要醇类化合物进行了分析。正丁醇、仲丁醇、2,3-丁二醇、正己醇和β-苯乙醇这5种化合物在老窖泥的上层酒到新窖泥的下层酒中呈现逐渐增加的趋势。其中，正丁醇和仲丁醇带有微苦的味道，适量的含量能够增加白酒的醇厚感和余味。2,3-丁二醇和正己醇具有甜味，随着含量的增加，能够为白酒带来醇甜感。而β-苯乙醇则具有玫瑰花的香气，为白酒赋予了独特的花香特点。

3 结论

浓香型白酒的功能性微生物在生长和繁殖过程中主要依赖于窖泥作为生态载体。窖泥中的功能性微生物种类以及它们之间的相互作用在浓香型白酒的风味形成过程中发挥着至关重要的作用。这些微生物种类在酿造过程中参与了复杂的代谢反应，产生了各种化合物，其中包括影响白酒风味的关键成分。它们的相互作用可以影响代谢产物的种类和含量，从而直接影响到白酒的香气特点和品质。然而，需要注意的是，窖泥中影响浓香型白酒风味的物质并不是在实验室条件下单一成分的简单存在。相反，这些物质是由己酸菌、产甲烷菌（Methanogenus）、乳杆菌属（Lactobacillus）等多种微生物共同存在的有机整体所组成，构成了一个复杂的相互作用体系。例如，产甲烷菌并不直接产生浓香型白酒风味化合物，但是产甲烷菌会解除已酸菌代谢产物氢的抑制作用，在同一窖池环境中产甲烷菌和己酸菌具有相同的变化趋势[42]。基于窖泥微生物体系的复杂性，需要从整体微生物群落水平研究窖泥微生物群落与产香化合物组成之间的关系，影响白酒风味的功能微生物还有待于进一步研究。