2018-2020年云南省边境地区猪群PRRSV抗体检测与分析

谢佳芮，寇美玲，李 乐，苗海生

(云南省畜牧兽医科学院，云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南 昆明 650224)

鉴于云南省紧邻东南亚国家，边境线上有多个通往内地的口岸和多条贩卖走私家畜的非法通道，受到利益驱使，我国边境很多不法分子以走私动物为盈，包括活体动物、动物产品等。这些行为，不仅偷逃国家税款、扰乱市场秩序，而且所走私的动物也有可能来自疫区，给我国畜禽养殖、公共卫生安全带来了极大的影响。东南亚国家兽医防控体系不完全，防控意识与水平薄弱，特殊的气候条件和地理环境，导致动物疫情发生风险较大，疫情防控形势严峻。为了解边境地区猪群PRRSV抗体水平，本试验于2018-2020年在边境14个地区采集了2 900份猪血清样品，进行了PRRSV抗体检测分析，对PRRSV抗体有计划的进行监测,准确掌握边境地区PRRSV的流行动态,了解边境地区猪群的免疫状态,对降低PRRSV风险有重要意义，以期为云南省PRRS的免疫防控提供流行病学数据，为相关的防控政策的研究与制定提供资料。

1 材料与方法

1.1 监测点选择

猪血清样品连续3年随机采自云南省富宁、勐腊、陇川、勐海、沧源、耿马、镇康、盈江、澜沧、景洪、孟连、瑞丽、芒市、禄丰14个边境县的218个散养户、43个养殖场、29个屠宰场、33个交易市场、3个填埋场。

1.2 样品采集及抽样原则

每个采样点利用无菌技术采集猪前腔静脉血3～5 mL，析出血清于灭菌离心管内，分别编号。对存栏量大于10头的养殖户，按照估计流行率方法采样：95%置信水平、10%预期流行率、5%可接受误差；对于存栏少于10头的养殖户，全群采样。由当地县级动物疫病预防控制中心负责样本采集，登记各区县样本数量以及样本来源、采样情况。其中，富宁县采集样品200份，勐腊县500份，勐海县200份，孟连县300份，沧源县235份，镇康县230份，耿马县235份，芒市100份，瑞丽市100份，盈江县100份，陇川县200份，澜沧县100份，景洪市300份，禄丰县100份(表1)。

表1 2018-2020年各地区猪血清样品采集数量统计 份，个

1.3 检测方法与判断标准

采用云南省畜牧兽医科学院自行研制的PRRSV ELISA抗体检测试剂盒进行检测。取出试剂盒提供的96孔ELISA板，每孔加入46 μL稀释液，4 μL待检血清，对照样品不加稀释液。震荡混匀；37℃温育1 h。PBST洗液洗板5次，拍干；每孔加入50 μL羊抗猪酶标二抗，37℃温育30 min，用PBST洗液洗板5次，拍干；每孔加入100 μL底物反应液，37℃避光温育10～15 min，再加入100 μL终止液终止反应，酶标仪450 nm波长下读取结果。当阳性对照平均OD值≥1，阴性对照平均OD值≤0.2，试验结果成立。检测仪器使用BioTek ELX-800酶标仪;AquaMax2000洗板机，购自Molecular Devices公司。按照以下公式进行结果判定：样品S/P值≤0.4，判为PRRSV抗体阴性;S/P值≥0.4，判为PRRSV抗体阳性。S/P=。PC：阳性对照OD值；NCA450：阴性对照OD值。采用IBM SPSS Statistics22软件对检测结果进行统计分析，分析抗体的S/P平均值、标准差、阳性率，用变异系数来表示各类别猪群的抗体的离散度，其中变异系数=(标准差÷S/P平均值)×100%，用卡方检验进行数据间显著性分析，用Excel2007软件统计数据。根据样品的背景记录，最后对检测的样品区分采样地区，采样猪群的类别，采样季度，以及采样的场点来分类进行统计。

2 结果与分析

2.1 边境地区猪群PRRSV抗体时间分布情况

以年份统计结果(表2)表明：2018—2020年，共检测样品2900份，检出抗体阳性2179份，2018—2020年平均抗体阳性率为75.14%(2179/2900)，各年的抗体阳性率分别为70.63%(986/1396)，73.81%(372/504)、82.1%(821/1000)。抗体阳性率都高于国家规定的PRRSV抗体水平标准(70%)，把能够达到国家规定的抗体水平标准(70%)定义为抗体合格率，且各年间无显著差异(P>0.05)。以季度统计结果(表3)表明：不同季度的PRRSV抗体阳性率均达到抗体合格率水平，且季度间无显著差异(P>0.05)。

表2 不同年份PRRSV抗体检测结果 份，%

表3 猪群不同采样季度PRRSV抗体平均阳性率统计 %

2.2 边境地区猪群PRRSV抗体地域分布情况

各县(市、区)猪群抗体阳性率在 50%～90%之间(表4)，并且地区间差异极显著(P<0.01)，其中抗体阳性率最高为孟连91.33%(274/300)。检测结果显示PRRSV在云南边境地区存在地域分布差异,且地区间差异较大。PRRSV抗体平均阳性率为75.14%(2179/2900)，S/P平均值为1.0510±0.7484，变异系数为70.77%，变异系数最高的为芒市158.1%，最低的盈江47.33%。沧源和富宁、勐腊、澜沧、陇川、勐海、孟连、盈江、禄丰这8个地区差异显著(P<0.05)，陇川和富宁、勐腊、澜沧、勐海、镇康、孟连、盈江、禄丰这8个地区差异不显著(P>0.05)。

表4 2018-2020年各地区猪PRRSV抗体检测结果统计 份，%

境内猪群和入境猪群PRRSV抗体统计表明(表5)，境内猪群PRRSV抗体阳性率为94.32%(1678/1779)，入境猪群PRRSV抗体阳性率为44.69%(501/1121)，利用SSPS软件进行两组阳性率数据无重复双因素方差分析，得出P<0.01,两组数据差异极显著。

表5 境内猪群和入境猪群PRRSV抗体统计 份，%

按照采样场点分类统计(表6)，来自交易市场、屠宰场以及养殖场的猪群抗体阳性率都在75%以上，散养户猪群抗体阳性率为60.29%(287/476)，散养户、填埋场的猪群抗体阳性率与其他场点相比差异极显著(P<0.01)。

表6 同采样场点的猪群PRRSV抗体统计

2.3 不同生产阶段猪群PRRSV抗体情况

哺乳仔猪的抗体阳性率最低为48.14%(297/617)。S/P值最高的是种猪(1.7248±0.1879)，S/P值最低为哺乳仔猪(1.0133±0.3373)。哺乳仔猪的变异系数最高(90.1%)、种猪的变异系数最低(49.85%)。不同猪群之间PRRSV平均抗体水平存在差异，种猪和哺乳仔猪、保育猪、育肥猪差异显著(P<0.05)；保育猪和哺乳仔猪差异不显著(P>0.05),见表7。

表7 2018-2020年不同类别猪群PRRSV抗体阳性统计 份，%

3 讨论

3.1 边境地区猪群免疫效果评价

边境地区14个县(市、区)猪群PRRSV抗体阳性率在50%～90%之间，PRRSV平均抗体阳性率为75.14%(2179/2900)，孟连、景洪、禄丰、镇康、瑞丽、澜沧、耿马、芒市、盈江、陇川、沧源各地猪群的PRRSV 抗体阳性率都高于国家规定的抗体水平标准(70%)，能够达到控制PRRSV疫情所达到的抗体水平(90%以上)有孟连。澜沧、盈江的猪群的变异系数均≤50%，说明抗体整齐度高，免疫状况良好。其他地区的变异系数均大于60%，对抗体整齐度不高，抗体阴性猪只多的地区还需要进行补免。2015年谭锐等检测到云南部分地区的PRRSV免疫抗体阳性率为69.6%。2013年至2015年，胡忠燕等对景洪市进行PRRSV抗体检测的平均阳性率为64.12%。2016年曾梦颖等对云南玉溪、曲靖、楚雄三地的血清样品中检测出PRRSV免疫抗体平均阳性率为47.85%。2017年朱丽等对云南多地的PRRSV抗体进行调查，除了丽江市以外，其他地区抗体平均阳性率都不低于70.00%。综合以上结果说明，近几年云南的PRRSV抗体阳性率呈逐年递增趋势。云南边境地区整体的PRRSV抗体变异系数为70.77%，变异系数越大，说明抗体水平不整齐，地区间抗体水平差异变大的原因有很多，常见的直接原因可能有：疫苗的注射和保存操作不当，使用的疫苗品牌参差不齐，质量不统一，不同地区采集的血清样本数本身具有差异，所得结果在一定程度上具有主观性，并不能完全客观的反应各地PRRSV免疫效果的真实情况等；间接原因常为：母源抗体干扰、免疫抑制疾病的感染、饲养管理不当、免疫程序制定不合理、动物来源途径复杂等。

3.2 各类别猪群抗体的差异

各生产阶段猪群的PRRSV 抗体水平存在差异。抗体水平最高的是育肥猪87.30%(949/1087)和种猪79.92%(426/533)，抗体阳性率较低的为哺乳仔猪48.14%(297/617)和保育猪76.47%(507/663)。根据以上数据分析原因，哺乳仔猪和保育猪抗体阳性率低，首先可以认为仔猪断奶，母源抗体水平下降；同时给仔猪转至保育圈舍时，断奶和环境改变容易产生应激性，使抗体水平下降。

通过监测发现，边境地区PRRSV猪群抗体水平呈逐年升高的态势，同时对比境外走私的猪群抗体和境内养殖的猪群抗体水平，发现两种来源的猪群PRRSV抗体水平差异显著，我国境内养殖的猪群抗体水平均在90%以上，而境外走私猪群抗体水平低于50%。由于外来猪群免疫背景不明确，试验数据在一定程度上只能说明境外走私入境的猪群免疫情况不容乐观，有可能存在入境猪群注射过PRRSV疫苗,但疫苗品质未可知，造成抗体保护率偏低；如果从未注射过疫苗,说明存在野毒感染抗体,可能入境的猪群已经存在PRRSV野毒感染,应该淘汰。境内猪群PRRSV抗体水平的持续提升，结合数据分析原因，可能是由于非洲猪瘟在我国大肆流行，经过非洲猪瘟疫情的影响，以及国家防疫政策的及时实施，使得生猪养殖主体生物安全意识大幅提高、更加重视疫病防控和饲养管理，严格执行了各项免疫程序，并在各关卡、各道路、各区域严格执行了消毒、隔离等工作。本研究采样点位于云南省边境地区，这些地区主要与缅甸、老挝、越南相邻，鉴于边境地区的特殊性，边民之间相互交易不可避免，这些国家的猪肉制品，经常在农贸市场销售, 猪群又常在边境两侧相邻牧场上交叉放牧或混群放牧，加之经常有境外走私的猪群流入我国境内，在这种情况下，动物疫病可能传染频繁，使得边境地区PRRSV抗体水平差异大，同时境外猪群非法入境频繁内调，将造成我国内地PRRSV的扩散。这不仅使国内重大动物疫病防控形势严峻，而且还涉及毒品残留，食品卫生安全等问题。

比较不同场点监测数据，养殖场、屠宰场和交易市场的抗体阳性率均在75%以上，说明边境地区疫病防控监督工作扎实，动物疫病防控人员积极督促养殖主体提升防疫水平，提高该病防控能力，使得猪群频繁汇集的地区，抗体水平能有效的防止疫情的发生。

4 结论和建议

本研究通过随机抽样方法，在云南边境14县(市、区)，抽取2900份猪血清样品进行PRRSV血清学检测，发现最近几年，边境地区猪群PRRSV抗体阳性率对比云南省其他地区有显著提升，不同地区PRRSV抗体阳性率存在差异，血清抗体阳性率的高低同时受到某些地区入境动物的影响。

为了使我国的畜牧业长足健康持续有效的发展，结合边境地区的特殊情况，提升边境地区猪群的PRRSV防疫管理，现提出以下建议：一是持续加强生物安全管控措施。具体方法为：加强对现有养殖场、屠宰场，牲畜交易市场严格管理的措施，加强猪群的免疫和检疫工作，隔离外来动物，加强生物安全措施、疫苗免疫接种，提高PRRSV的免疫密度和抗体水平。二是制定严格的消毒措施，从根本上消灭病原、切断一切传播途径和保护易感动物，严控边境地区易感动物的无序流动，降低境外动物对国内家畜的威胁。三是加大推广PRRSV灭活疫苗的应用。鉴于疫苗免疫并不能完全控制疫情发生，而PRRSV减毒活疫苗长期大量频率的使用，给PRRSV自然重组创造了更加便利的条件和机会，疫苗的使用需要专业技术人员的指导，边境地区技术人才缺乏，存在疫苗使用不规范、频繁无序现象，从而导致该病复杂程度随毒株增多而加剧疫情的发生。因此，PRRSV灭活疫苗在边境地区的使用还是优于减毒活疫苗，且没有扩散风险，同时能抑制患病猪只肺部病变，在较长的一段时间使得机体不断的产生抗体，所以今后应考虑在基层加大推广应用。四是加强对哺乳仔猪和保育猪群的防控。最后，边境地区的防控工作，还应按照不同区域的实际情况，分别在引种安全性、物流水平、饲养主体的管理水平、生物安全性上采取坚持处理主要矛盾为主、次要矛盾为辅的防控策略。