一株拮抗柑橘绿霉病海洋微生物的分离筛选鉴定及其所产活性物质稳定性研究

凌晓宁，鄢陆琪，张 荣，章启慧，李昆太，*

（1.江西农业大学 生物科学与工程学院/江西省农业微生物资源开发与利用工程实验室，江西 南昌 330045；2.广东海洋大学 食品科技学院，广东 湛江 524088）

【研究意义】柑橘类水果风味独特，果实含有大量维生素C、类胡萝卜素、果胶等生物活性物质，深受消费者的喜爱[1]。由于柑橘营养成分丰富，在柑橘采摘、运输及储存过程中，容易受到病原体的感染，其中由指状青霉（Penicillium digitatum）引起的绿霉病是采后柑橘最具破坏性的病害，占柑橘储藏过程因真菌性病害造成腐烂损失的60%～80%[2]。目前，对于柑橘绿霉病的防治主要采用化学杀菌剂如抑霉唑、噻苯咪唑、咪鲜胺等，但这些化学农药的过渡使用往往容易导致病原真菌的耐药性，且对人体健康存在一定的风险，因此寻求绿色安全可靠的生物防治方法成为了研究者们的关注热点[3]。【前人研究进展】对柑橘绿霉病的生物防治方法主要包括使用植物提取物[4]、抗菌肽[5]及拮抗微生物[6]等，其中以使用拮抗微生物的方法研究最多。开展柑橘绿霉病微生物防治的首要工作是获得对病原真菌具有拮抗活性且能适应柑橘贮藏运输环境的拮抗微生物。近年来，已从陆地环境如根际土壤[7-9]、柑橘果实和叶片[10]等处分离出大量拮抗柑橘绿霉病菌的微生物，主要为细菌、酵母菌和放线菌。由于对陆地资源进行了广泛的微生物筛选和研究，发现新的微生物变得越来越困难[11]。海洋蕴含着丰富的微生物资源，海洋微生物生活在高盐、低温、无光照、寡营养等极端环境中，这些环境决定了其与陆地微生物生长代谢的差别，使得其具有产生独特生物活性化合物的潜力[12]。过去的几十年间，海洋微生物已被证实是生物活性化合物的重要来源，其代谢产物具有多种药理活性，包括抗癌、抗菌、抗肿瘤等，被喻为生产天然产物的微生物工厂[13]。利用海洋微生物防治柑橘绿霉病的报道较少，目前的研究主要集中在海洋放线菌。鹿连明等[14]分离到一株对柑橘青霉病菌（P.italicum）、绿霉病菌（P.digitatum）具有强抑制作用的海洋放线菌米修链霉菌A3202（Streptomyces misionensisA3202），Hu 等[15]分离到一株海洋来源的链霉菌Streptomyces chumphonensisAM-4，其发酵液对指状青霉（P.digitatum）和意大利青霉（P.italicum）的菌丝生长抑制率分别为66.23%和61.42%。而对于海洋细菌、真菌防治柑橘绿霉病仍缺乏相关研究。

【本研究切入点】目前，对于柑橘绿霉病菌具有拮抗作用的菌株大多筛选自陆地环境，鲜有从海洋环境中筛选拮抗菌株的报道。海洋与大陆有较大的环境差别，其微生物与陆地微生物相比具有不同的特征[16]，因此从海洋中有望筛选到产特殊抑菌活性物质的拮抗菌株。【拟解决的关键问题】筛选对指状青霉具有拮抗作用的海洋来源微生物，并探讨筛选获得的菌株对高盐的耐受性及其所产抑菌活性物质的稳定性，以期为柑橘绿霉病的生物防治提供菌种资源，为微生物拮抗剂的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源 样 品采自广 东 省湛江市5 个海底 淤 泥（20°33′08.42467″N，109°36′51.68500″E；20°33′01.52869″N，109°37′09.79277″E；20°33′04.97675″N，109°37′00.73894″E；20°31′52.78761″N，109°38′13.75760″E；20°29′09.04517″N，109°38′26.98106″E），保存于4 ℃冰箱。

1.1.2 供试菌株 指状青霉（Penicillium digitatum），保存于江西省农业微生物资源开发与利用工程实验室。

1.1.3 主要培养基 改良LB 培养基：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，MgCl22.1 g，MgSO44.2 g，KCl 0.9 g，CaCl21.2 g，NaCl 36.5 g，蒸馏水1 L，pH 7.0，其中固体培养基添加20 g 琼脂，121 ℃灭菌20 min；高氏一号培养基：可溶性淀粉20 g、KNO31.0 g、K2HPO40.5 g、FeSO40.01 g、MgCl22.1 g，MgSO44.7 g，KCl 0.9 g，CaCl21.2 g，NaCl 30 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH 7.2，121 ℃灭菌20 min；PDA 培养基：去皮土豆（八层纱布过滤）200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 L，pH 自然，其中固体培养基添加琼脂20 g，121 ℃灭菌20 min；发酵培养基：葡萄糖30 g，蔗糖30 g，蛋白胨20 g，硫酸铵2 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁 1 g，硫酸锰 0.01 g，硫酸锌0.01 g，蒸馏水1 L，pH 7.0～7.2，115 ℃灭菌30 min。

1.1.4 主要试剂 细菌基因组DNA提取试剂盒，生工生物工程（上海）有限公司；丙三醇，西陇科学；胃蛋白1∶10 000，胰蛋白酶1∶250，蛋白酶K，北京索莱宝科技有限公司。

1.1.5 主要仪器 显微镜ECLIPSE Ni（日本尼康），扫描电子显微镜QUANTA 250（美国FEI 公司），立式压力蒸汽灭菌器LDZX-50KBS（上海申安医疗器械厂），高速冷冻离心机JW-2019HR（安徽嘉文仪器装备有限公司），PCR 仪T-100（美国Bio-rad 公司），电泳仪DYCP-31DN（北京六一生物科技有限公司），三孔电热恒温水槽DK-8D（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司），生化培养箱LRH-250A（韶关泰宏君仪器有限公司），紫外可见分光光度计GENESYS 50（赛默飞世尔科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 海洋微生物的分离筛选 称取10 g 海泥，加入装有90 mL 无菌水（带玻璃珠）的三角瓶中，混合均匀梯度稀释到10-4。吸取10-3、10-4稀释液分别涂布在改良LB、高氏一号培养基平板上，28 ℃培养至菌落出现并计数。挑取单菌落进行划线纯化3次，将纯化的单菌落接种到改良LB液体培养基中培养，所得菌液加入到含25%甘油的冻存管中于-80 ℃保存。

1.2.2 指状青霉孢子悬液的制备 取指状青霉斜面，使用20 mL 无菌水倒入斜面刮下孢子，制备成孢子悬液，使用血球计数板计数，调整孢子浓度为1×108spores/mL，于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 拮抗菌的初筛 采用平板对峙法，将筛选获得的海洋细菌分别接种于装有50 mL 改良LB 液体培养基的250 mL 锥形瓶中，于30 ℃、160 r/min 活化12 h，分别取菌液100 μL，涂布于改良LB 固体培养基中，获得单菌落。将单菌落分别点接于含1%指状青霉孢子悬液的PDA 培养基中，于30 ℃培养48 h，观察拮抗效果。

1.2.4 拮抗菌的复筛 将初筛获得的具有拮抗指状青霉效果的海洋细菌分别接种于装有50 mL改良LB液体培养基的250 mL 锥形瓶中于30 ℃、160 r/min 活化12 h，将活化后的菌液按2%的接种量（V/V）接种于装有40 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，继续于30 ℃、160 r/min培养48 h，发酵液于10 000 r/min离心20 min，取发酵上清液于0.22 μm 滤头过滤，即得无菌的发酵上清液（Cell-free supernatant，CFS），以不接菌的发酵培养基培养液作为对照组（Control check，CK）。利用牛津杯法[17]检测发酵上清液的抑菌效果，按1%的接种量（V/V）将指状青霉孢子悬液接种至冷却到50 ℃的PDA琼脂培养基中，摇匀后倒平板，待平板凝固后，均匀放置牛津杯，加入CFS 200 μL，于培养箱中培养48 h至出现抑菌圈，使用游标卡尺测量抑菌圈直径，每株菌重复3次。

1.2.5 菌株HY 2-1的形态、生理生化特性及16S rDNA序列分析 将保存的菌株划线接种于改良LB培养基中，30 ℃培养24 h，观察菌落形态特征。挑取平板中的单菌落，经过革兰氏染色后于光学显微镜观察菌落形态结构。参考张文平等[18]的方法使用扫描电镜对菌株进行观察。参考《常见细菌系统鉴定手册》[19]对菌株的部分生理生化进行鉴定。

将菌株HY 2-1 斜面刮入装有20 mL 无菌水（含玻璃珠）的三角瓶中，接入1 mL 于改良LB 培养基培养12 h，使用基因组DNA提取试剂盒提取菌株DNA模板，分别使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-AAGTCGTAACAAGGTAACG-3′）进行PCR 扩增。体系为：模板5 μL，细菌通用引物27F、1492R 各取2 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，无菌双蒸水16 μL，总体积为50 μL。条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，退火55 ℃ 15 s，72 ℃延伸30 s，循环34 次；之后72 ℃延伸5 min，于4 ℃保存。将扩增片段经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行16S rDNA 测序。将测序结果于NCBI数据库进行比对，选取比对后菌株的16S rDNA 序列，使用MEGA-X软件绘制系统发育树。

1.2.6 菌株HY 2-1 对盐的耐受性 配置氯化钠质量浓度分别为5，10，20，30，40，50，70，90，110，130，150，170，200 g/L 的发酵培养基，将菌株HY2-1 于改良LB 培养基活化12 h，活化的菌液按2%的接种量（V/V）接种于上述不同氯化钠浓度的发酵培养基（装液量40 mL/250 mL）中，发酵48 h 后于600 nm 处测定各培养液吸光度，记录OD值。

1.2.7 抑菌活性物质稳定性检测（1）热稳定性检测。将CFS 分别分装于5 个10 mL 离心管中，于40，60，80，100 ℃水浴30 min，第5个离心管于121 ℃高压保持20 min，经牛津杯扩散法测试各处理的抑菌活性，以不处理的CFS为空白对照，每个处理重复3次，使用游标卡尺测量抑菌圈直径，下同。

（2）紫外照射稳定性检测。取CFS 20 mL 放入灭菌的平板中，打开盖置于20 w 紫外灯下照射，分别于5，10，15，20，30，40，50 min 取样装入灭菌的离心管中，经牛津杯扩散法测试各处理的抑菌活性，以不处理的CFS为空白对照，每个处理重复3次。

（3）pH 稳定性检测。将CFS 分别分装于6 个10 mL 离心管中，使用6 mol 的NaOH 和1 mol 的HCl 调节pH 至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0，并于37 ℃水浴2 h，调至CFS 初始pH 值（6.25），经牛津杯扩散法测试各处理的抑菌活性，以不处理的CFS为空白对照，每个处理重复3次。

（4）酶处理检测。将CFS分别分装于4个10 mL 试管中，分别用胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K 处理，终质量浓度为1 mg/ml，于37 ℃水浴锅中水浴2 h，取出试管于沸水浴中灭活5 min，经牛津杯扩散法测试各处理的抑菌活性，以不加酶处理的CFS同样处理为空白对照，每个处理重复3次。

1.3 数据分析

使用Excel 2019 进行数据统计，采用DPS 软件进行数据统计分析，Duncans 新复极差法进行多重比较，使用Origin 2018对数据进行作图分析。

2 结果与分析

2.1 柑橘绿霉病拮抗菌株的初筛

从5 个海泥样品中筛选出30 株菌落形态不一且呈明显细菌特征的菌株，对30 株海洋细菌开展拮抗实验，发现编号为HY 2-1、HY 4-2、HY 8-4-1、HY 8-7 的4 株菌具有拮抗指状青霉的能力，其拮抗效果如图1 所示。选择上述4株菌作为初筛菌株，用于进一步的复筛。

图1 拮抗指状青霉海洋细菌的初筛Fig.1 Preliminary screening of antagonistic Marine bacteria against Penicillium digitatum

2.2 柑橘绿霉病拮抗菌株的复筛

对初筛获得的4 株拮抗菌进行牛津杯复筛，其对指状青霉的抑菌结果如表1所示。由表1可知，4株拮抗菌的CFS 中仅有编号为HY 2-1 和HY 4-2 两株菌对指状青霉具有明显的抑菌作用，编号为HY 8-4-2 和HY 8-7的菌株抑菌圈只有牛津杯直径的大小（6.8 mm）。拮抗菌HY 2-1 抑菌圈直径大于HY 4-2，且差异具有显著性（P＜0.05），因此后续实验选择HY 2-1 作为出发菌株。HY 2-1菌株CFS对指状青霉的抑菌作用如图2所示。

图2 HY 2-1菌株CFS对指状青霉的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of CFS of strain HY 2-1 on Penicillium digitatum

表1 4株拮抗菌复筛结果Tab.1 Rescreening results of 4 antagonistic strains

2.3 柑橘绿霉病拮抗菌株HY 2-1的鉴定

2.3.1 菌株HY 2-1形态学观察 拮抗菌HY2-1单菌落特征为：乳白色，表面光滑，菌落边缘整齐，较湿润，菌落直径相对较小（图3a）；对该菌进行革兰氏染色，于光学显微镜观察，菌株为短杆状，为革兰氏阳性菌（图3b）；由扫描电子显微镜观察可知，该菌株边缘整齐，呈典型的短杆状（图3c）。

图3 菌株HY2-1的形态特征Fig.3 Morphological characteristics of strain HY2-1

2.3.2 菌株HY 2-1生理生化特性菌株HY2-1 的部分生理生化鉴定结果如表2所示。结果显示，菌株HY2-1能够利用葡萄糖、木糖、半乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇作为唯一碳源，吲哚实验和甲基红试验呈阳性，能液化明胶，水解淀粉，还原硝酸盐，V-P实验、脲酶和接触酶实验为阴性，不能利用柠檬酸盐。

表2 菌株HY 2-1的生理生化特性Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of strain HY 2-1

2.3.3 菌株HY 2-1 分子生物学鉴定 以细菌16S 通用引物27F 和1492R 为引物，菌株HY 2-1 基因组DNA 为模板，PCR扩增电泳检测结果如图4。由图4 可知，用1%琼脂糖凝胶电泳检测到条带一有1 条单一的DNA 片段条带，与DNA Marker相比较，PCR扩增的DNA片段条带在1 500 bp 附近，长度约1 500 bp 左右。

图4 菌株HY 2-1基于16S通用引物PCR扩增产物电泳图Fig.4 Electrophoresis of PCR amplification products of strain HY 2-1 based on 16S universal primer

将菌株HY 2-1的16S rDNA 序列，通过在线程序NCBI中的BLAST 与Genbank 中的其他保藏序列进行比较，将比对结果使用MEGA X 软件中的Neighbor-joining 方法构建系统发育树，结果如图5 所示。由图5 可知，菌株HY 2-1 与已公布的Bacillus amyloliquefaciens（GenBank 登录号MN174660.1）聚为一簇，同源性为99.93%，确定菌株HY 2-1为解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens），将其命名为解淀粉芽孢杆菌HY 2-1（B.amyloliquefaciensHY 2-1），其16S rDNA 序列已提交至NCBI，GenBank登录号为MZ709015。

图5 基于16S rDNA序列构建的菌株HY 2-1系统发育树Fig.5 The phylogenetic tree of HY 2-1 strain based on 16S rDNA sequence

2.4 解淀粉芽孢杆菌HY 2-1对盐的耐受性

由图6可知，添加不同质量浓度的氯化钠对HY2-1的生长具有先促进后抑制的作用。当氯化钠质量浓度为5 g/L时，菌体含量达到最大值，与不添加氯化钠相比，菌体含量显著增加；继续增加氯化钠质量浓度至10 和20 g/L，菌体含量开始呈下降的趋势但始终高于不添加氯化钠组，直至氯化钠质量浓度增加至30 g/L 时，菌体含量才开始小于不添加氯化钠组；菌体在130 g/L氯化钠质量浓度下仍有一定的生长，而当氯化钠质量浓度达到150 g/L 及以上时，菌体生长才完全被抑制。以上结果表明，海洋来源的HY2-1菌株具有良好的盐耐受性，而且盐质量浓度在20 g/L范围内对菌体生长反而有明显的促进作用。

图6 不同氯化钠质量浓度对B.amyloliquefaciens HY2-1生长的影响Fig.6 Effect of different sodium chloride concentrations on the growth of B.amyloliquefaciens HY2-1

2.5 解淀粉芽孢杆菌HY 2-1发酵上清液稳定性

不同紫外照射时间、温度、pH和酶处理对菌株HY 2-1发酵上清液稳定性的影响如图7所示。由图7（a）可知，利用20 w 紫外灯照射5～60 min，菌株HY 2-1 的CFS 抑菌圈直径呈现平稳趋势，经不同时间紫外照射的处理组与对照组相比差异不显著（P＞0.05），表明菌株HY 2-1 的CFS 在短时间的紫外照射下稳定性较好；由图7（b）可知，随着温度的升高，CFS 的抑菌圈直径呈现下降的趋势，与对照组相比，40 ℃和60 ℃处理的CFS 抑菌圈直径差异不显著（P＞0.05），80 ℃、100 ℃和121 ℃处理的CFS 抑菌圈直径差异显著（P＜0.05），且121 ℃处理的抑菌圈直径与对照组相比减少了45.33%，表明菌株HY 2-1 的CFS 在60 ℃以上高温处理下稳定性较差，这可能是高温破坏了菌株HY 2-1 的CFS 中抑菌活性物质的结构；由图7（c）可知，与对照组相比，pH 在3～9 范围内CFS 的抑菌圈直径差异不显著（P＞0.05），pH 大于11 时CFS 的抑菌圈直径出现显著下降（P＜0.05），这表明菌株HY 2-1的CFS在酸性及弱碱性条件下稳定性较好，在强碱处理下稳定性较差；由图7（d）可知，与对照组相比，菌株HY 2-1的CFS经胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K 处理后，抑菌圈直径显著降低（P＜0.05），且经胃蛋白酶、蛋白酶K 处理后的CFS，其抑菌活性几乎丧失，这表明菌株HY 2-1的CFS具有蛋白质属性，推测抑菌活性物质中含有蛋白类物质。

图7 不同处理对B.amyloliquefaciens HY 2-1发酵上清液稳定性的影响Fig.7 Effect of different treatments on the stability of Cell-free supernatant of B.amyloliquefaciens HY 2-1

3 结论与讨论

细菌是生防微生物的重要资源，其中解淀粉芽孢杆菌是目前生物防治研究较多的生防细菌。已有研究表明，解淀粉芽孢杆菌对马铃薯疮痂病[20]、桃褐腐病[21]、水稻基腐病[22]等多种植物病害具有拮抗作用，具有广谱抗真菌活性。解淀粉芽孢杆菌在拮抗柑橘绿霉病菌方面也有报道，吕捷等[23]从田间分离到一株B.amyloliquefaciensBs43，其菌悬液对指状青霉的抑菌圈直径达28 mm，Chen等[24]从柑橘根际土壤分离到一株B.amyloliquefaciensDH-4，其对指状青霉的抑菌圈直径高达（55.6±0.5）mm。在本研究中，筛选到一株对指状青霉具有较好拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌HY 2-1（B.amyloliquefaciensHY 2-1），该菌分离自生境相对特殊的海洋环境，与分离自陆地的B.amyloliquefaciens相比，海洋微生物适应了高盐、寡营养等特殊生存环境，在抗逆性方面具有一定优势，由此产生的活性物质往往具有耐受温度、pH 范围广等特点，且该菌具有一定的耐盐性，为适用于复杂的应用场景提供了基础。该菌的CFS对指状青霉具有明显的拮抗作用，其抑菌圈直径达到（21.88±0.19）mm，从该菌对指状青霉拮抗效果可知，海洋源微生物具备一定的应用前景，不仅可以丰富柑橘绿霉病拮抗菌的来源，也可为生防制剂的开发奠定基础。

芽孢杆菌抑菌活性物质的稳定性易受外界条件的影响，陈超等[25]研究了解淀粉芽孢杆菌M9（B.amyloliquefaciensM9）发酵液稳定性，其在40～100 ℃处理30 min抑菌活性不变，紫外稳定性强，pH高于9或低于7 时抑菌活性明显降低。李亮亮等[26]研究了解淀粉芽孢杆菌WS3-1（B.amyloliquefaciensWS3-1）发酵液中活性物质的稳定性，其活性物质在温度为40，60，80 ℃及pH 8～10条件下抑菌活性稳定，抑菌率保持80%以上，同时具有较好的紫外线稳定性。Alfonzo 等[27]研究了解淀粉芽孢杆菌AG1（B.amyloliquefaciensAG1）产生的抗真菌代谢产物的稳定性，其在温度为60～120 ℃，pH 2～10 条件下抑菌活性保持稳定，且经1 mg/mL 的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶、蛋白酶K 等酶处理后，抑菌活性保持不变。通过对菌株HY 2-1 的CFS 稳定性检测，发现其在5～60 min 的紫外照射后，抑菌活性与对照相比无显著变化，具有很强的紫外稳定性；在80 ℃处理后抑菌活性才出现显著下降但保持了83.86%的抑菌活性，具有一定的热稳定性；在pH值3～9范围内抑菌活性稳定，但对强碱敏感；经胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K处理后，抑菌活性出现显著降低（P＜0.05），对蛋白酶敏感。

采后柑橘在储藏期易受青霉病菌和绿霉病菌的感染，造成果品质量下降及经济损失。微生物法作为抑制植物病害的一种安全的生物防治方法，目前已在柑橘采后病害防治中得到一定的应用[28]。本研究筛选出了一株对柑橘采后最易诱发且造成损失最大的绿霉病病原菌—指状青霉具有较好拮抗作用的B.amyloliquefaciensHY 2-1，探究了该菌对高盐的耐受性，并验证了该菌CFS的稳定性。值得注意的是，B.amyloliquefaciensHY 2-1对指状青霉抑菌活性评估及其自身活性物质稳定性测试，是基于成分复杂的CFS而非单体活性物质。因此，还需要进一步对CFS进行分离纯化，以确定其活性化合物的种类和数量，并开展活性物质结构鉴定与解析等后续研究。