纤维素分解酶对凤梨渣青贮品质及干物质降解率的影响

王志敬，吴征敏，尹福泉*，谭伟军，高振华，赵志辉

（1.广东海洋大学 滨海农业学院，广东 湛江 524000；2.广东省清远市动物疫病预防控制中心，广东 清远 511518）

【研究意义】凤梨（Ananas comosus）渣是指凤梨加工过程中产生的包括凤梨果皮、花萼、叶片等不可食用部分，直接丢弃不仅对生态环境造成负面影响，而且也是对资源的一种浪费，如果能通过加工将其用作动物饲料对于发展环境友好型畜牧业、减少饲料用粮具有重要意义。【前人研究进展】新鲜凤梨渣因含有甙类物质和菠萝蛋白酶等物质，不能直接饲喂动物，国内外研究表明凤梨渣经青贮[1-2]或者脱水[3]处理后可消除甙类物质和菠萝蛋白酶等物质，将其作为常规青贮饲料替代品饲喂动物，对动物无不良影响[4]，同时可以改善动物的生产性能[5]和胃肠道生理状态[6]。青贮改良剂不仅可以改善青贮饲料的青贮品质，而且可以提高动物生产性能和养分利用率[7-15]，研究表明，添加纤维素分解酶可以提高苋菜青贮饲料的青贮品质和有氧稳定性[7]，在桑叶[8,15]、狼尾草[10]、稻草[12,14]、构树叶[13]等青贮饲料中添加纤维素分解酶可提高CP、降低NH3-N/TN，提高青贮品质和养分利用率。【本研究切入点】凤梨渣经处理后可作为畜禽饲料优良替代品，纤维素分解酶可以显著改良青贮饲料的青贮品质和养分利用效率。但是，关于纤维素分解酶对青贮凤梨渣饲料青贮品质改良方面的研究较为鲜见。【拟解决的关键问题】本研究分析纤维素分解酶不同添加比例对凤梨渣青贮品质及干物质降解率的影响，从而为凤梨渣的科学利用提供更多参考资料。

1 材料与方法

1.1 凤梨渣青贮试验

1.1.1 试验材料 凤梨渣：取自湛江某菠萝罐头加工厂，新鲜凤梨渣切成1.5 cm 左右大小后风干至水分含量为65%～70%。干物质、粗灰分、粗蛋白、粗纤维、中洗纤维、酸洗纤维、钙、磷含量（风干基础）分别为：92.43、6.18、10.13、15.9、46.52、21.71、0.28、0.16。

纤维素分解酶：系采用里氏木霉菌种（Trichoderma reeasei）进行深层培养，然后将发酵液过滤除菌精制而成，成品酶活力为（1.5±0.5）万u/g（在37 ℃，pH为5.5的条件下，每分钟从浓度为4 mg/mL的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1 μmol 还原糖所需要的酶量为1 个酶活力单位），是多组分的酶系，除纤维素分解酶外，还含有半纤维素分解酶，β-1，4-葡娶糖酶，木聚糖酶，纤维二糖酶等成分。

1.1.2 试验设计 试验设置对照组（Ⅰ组）和纤维素分解酶处理组（Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组），纤维素分解酶添加量分别为1 500，3 000，6 000 u/kg，按每1 000 cm31 kg 填充于真空袋中，用真空泵（真空度：-60 KPa）自动抽真空封口，每组3个重复，每个重复6包。常温青贮（第二季度，室内平均气温为26.5 ℃）4周，随机选择3包混合均匀后取凤梨渣青贮鲜样10 g+90 mL超纯水4 °C存放24 h后取滤液测定pH、有机酸，剩余样品先在105 °C微生物灭活30 min，再65 °C烘至恒重后测定常规养分指标和干物质降解率。

1.2 体外发酵试验

1.2.1 发酵液的制备 将人工唾液（参照王志敬[16]方法配制）和瘤胃液按9∶1 比例（体积比）混合制取。瘤胃液取晨饲前的黑山羊（采集前禁食12 h，禁水4 h）瘤胃液经四层医用纱布过滤后制得，期间注意保温（39.0±0.5）°C并持续通入CO2。

1.2.2 体外发酵培养 首先称取1.25 g 风干凤梨渣青贮饲料无损转移至200 mL 玻璃培养瓶中，迅速加入70 mL 1.2.1 配制的发酵液（期间不断往发酵瓶内充入CO2，确保培养瓶内无氧气），用橡胶塞封口后置于（39.0±0.5）°C的恒温振荡培养箱内，分别培养2，4，6，9，12，24，48，72 h，每组重复3次。

1.3 测定指标与方法

干物质（dry matter，DM）参照GB/T 6435-1986；粗蛋白（crude protein，CP）参照GB/T 6432—2018；粗纤维（crude fiber，CF）参照GB/T 6434—2006；粗灰分（crude ash，Ash）参照GB/T 6438—1992；中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）参照GB/T 20806—2006；酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）参照NY/T 1459—2007；钙（calcium，Ca）参照GB/T 6436—2018；磷（phosphorus，P）参照GB/T 6437—2018；pH、有机酸、氨态氮（Ammonia nitrogen，NH3-N）参照DB15/T 1458—2018；可溶性多糖（water soluble carbohydrates，WSC）采用蒽酮比色法；亚硝酸盐参照GB 13085—1991方法测定。

1.4 计算公式

1.4.1 干物质降解率（dry matter degradation Rate，DMD）的计算：

1.4.2 相对饲喂价值（relative feed value，RFV）的计算：

式（2）（3）（4）中：DMI（dry matter intake）为青贮饲料DM的随意采食量（%）；DDM（digestible dry matter）为可消化干物质含量（%）；1.29为盛花期紫花苜蓿的DMI×DDM；RFV为相对一特定标准牧草[紫花苜蓿（Medicago sativa）]，某种牧草可消化干物质的采食量。

1.5 数据处理

采用Excel 2019初步整理后，用SPSS 19.0软件中One-Way ANOVA（单因素方差分析）、GLM Repeated Measure（重复测量方差分析）、Analyze-correlate-bivariate（双变量）进行处理，多重比较用Duncan 进行统计分析，结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同纤维素分解酶添加量对凤梨渣青贮品质的影响

由表1 可知，Ⅱ组DM 含量显著低于其他组别（P＜0.05）；各组间粗灰分（crude ash，Ash）、钙（calcium，Ca）、磷（phosphorus，P）差异不显著（P＞0.05）；Ⅳ亚硝酸盐含量显著高于其他组别（P＜0.05），Ⅱ组亚硝酸盐含量最低；Ⅱ组可溶性多糖（water soluble carbohydrates，WSC）含量显著高于其他组别（P＜0.05）；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组粗蛋白质（crude protein，CP）显著高于Ⅰ组（P＜0.05），分别较Ⅰ组提高13.86%、19.45%、13.58%；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组NH3-N 和NH3-N/TN 均显著低于Ⅰ组（P＜0.05），分别较Ⅰ组降低11.69%、29.87%、24.68%和22.54%、41.97%、33.81%；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组乳酸（lactic acid，LA），总挥发性脂肪酸（total volatile fatty acids，TVFA），乳酸与总挥发性脂肪酸比值（LA/TVFA）均显著（P＜0.05）高于Ⅰ组，分别较Ⅰ组提高21.79%、20.10%、33.83%，17.83%、14.96%、25.69%，3.17%、4.36%、6.33；乙酸（acetic acid，AA），丙酸（propionic acid，PA）均高于Ⅰ组，分别较Ⅰ组提高11.86%、7.28%、13.38%，15.28%、8.20%、23.91%。

表1 不同纤维素分解酶添加量对凤梨渣青贮品质的影响Tab.1 Effects of different amounts of cellulase on the quality of pineapple residue silage

2.2 不同纤维素分解酶添加量对青贮凤梨渣纤维物质和相对饲喂价值的影响

由表2 可知，纤维素分解酶添加组的pH 均小于对照组（P＞0.05），分别较对照组低0.93%、0.47%、0.47%；纤维素分解酶添加组粗纤维（crude fiber，CF）含量均低于对照组（P＞0.05），分别较Ⅰ组降低5.22%、3.60%、2.17%；纤维素分解酶添加组的中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）含量均显著低于对照组（P＜0.05），分别较Ⅰ组降低2.53%、3.72%、3.72%；纤维素分解酶添加组的酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）含量均高于对照组（P＞0.05），NDF 含量差异水平达到显著水平（P＜0.05），但是纤维素分解酶添加组组间差异不显著（P＞0.05）；纤维素分解酶添加组的相对饲喂价值（relative feed value，RFV）均高于对照组（P＞0.05），Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组的RFV较对照组分别提高2.35%、2.85%、3.52%。

表2 不同纤维素分解酶添加量对青贮凤梨渣纤维物质和相对饲喂价值的影响Tab.2 Effects of different amounts of cellulase added on the fiber matter and relative feeding value of silage pineapple residue

2.3 发酵时间、纤维素分解酶添加量对青贮凤梨渣干物质降解率的影响

由表3 和表4 可知，纤维素分解酶添加水平的F=10.703，P=0.000＜0.01，表明纤维素分解酶添加水平对干物质降解率（dry matter degradation rate，DMD）的影响达到极显著水平（P＜0.01）；发酵时间的F=1 688.167，P=0.000＜0.01，表明瘤胃发酵时间对DMD 的影响达到极显著水平（P＜0.01）。由表4可知，瘤胃发酵时间对DMD 影响显著，且随着发酵时间的增加DMD 逐步增加，发酵24 h 时达到高峰期；发酵4 h 时，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组的DMD 显著高于对照组（P＜0.05）；发酵6 h，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组的DMD 均高于对照组，Ⅲ组最高，显著高于Ⅰ组（P＜0.05）；发酵6 h，Ⅳ组的DMD 显著高于对照组（P＜0.05），Ⅱ、Ⅳ组次之，Ⅰ组最低。

表3 发酵时间、纤维素分解酶添加量对干物质降解率影响的方差分析结果Tab.3 Analysis of variance results of the effect of fermentation time and cellulase addition on the dry matter degradation rate

表4 不同纤维素分解酶添加量对青贮凤梨渣干物质降解率的影响Tab.4 Effects of different amounts of cellulase on the dry matter degradation rate of silage pineapple residue

2.4 凤梨渣青贮饲料养分、青贮指标和干物质降解率的相关性分析

由表5 可知，瘤胃发酵2 h，CP 与DMD 呈显著正相关关系（P＜0.05），NH3-N、NDF 与DMD 呈显著负相关关系（P＜0.05），NH3-N/TN 与DMD 呈极显著负相关关系（P＜0.01）；瘤胃发酵4 h，AA 与DMD 呈显著正相关关系（P＜0.05）；瘤胃发酵6 h，CP 与DMD 呈显著正相关关系（P＜0.05），NH3-N/TN 与DMD 呈显著负相关关系（P＜0.05）；瘤胃发酵9 h，NDF 与DMD 呈显著负相关关系（P＜0.05），RFV 与DMD 呈显著正相关关系（P＜0.05）；瘤胃发酵24 h，LA、TVFA 与DMD 呈极显著正相关关系（P＜0.01），AA、PA、LA/TVFA、RFV 与DMD 呈显著正相关关系（P＜0.05）；瘤胃发酵48 h，与DMD 呈极显著正相关关系（P＜0.01），PA、TVFA 与DMD 呈显著正相关关系（P＜0.05）；瘤胃发酵72 h，LA、AA、TVFA、RFV 与DMD 呈显著正相关关系（P＜0.05）。

表5 凤梨渣青贮饲料养分、青贮指标和干物质降解率的相关性分析Tab.5 Correlation analysis of pineapple residue silage nutrients，silage indicators and dry matter degradation rate

3 讨论

3.1 不同纤维素分解酶添加量对凤梨渣青贮品质的影响

纤维素分解酶是由真菌和细菌产生的一种多组份酶，可以吸附在纤维素上以纤维素为碳源将纤维物质分解为葡萄糖，同时对植物细胞壁具有一定的溶解作用，其在青贮饲料和果蔬加工中具有较为广泛的应用范围。Mu等[7]用纤维素分解酶处理苋菜和稻草后进行混合青贮，相较于对照组，纤维素分解酶处理组的乳酸菌等有益菌丰度较对照组有所提高，魏氏菌等有害菌丰度、NH3-N、pH等降低，本研究也表明添加纤维素分解酶可以提高CP，降低NH3-N、NH3-N/TN、pH，与He 等[8]、Li[9]、吴长荣等[13]研究结果均一致，表明纤维素分解酶可以促进凤梨渣青贮饲料保持较低的pH，抑制有害微生物对CP的水解，从而降低NH3-N、NH3-N/TN。本研究还表明Ⅱ组的WSC 显著高于其他组，DM 显著低于其他组，其他添加组和对照组间差异均不显著，其原因可能是纤维素分解酶添加浓度不同，高浓度组纤维素分解酶作用能力强，快速将纤维素等分解为WSC和乙醇等挥发性物质，乳酸菌等有益微生物利用WSC合成乳酸，致使pH 下降速度快，微生物停止活动早；低浓度纤维素分解酶组，由于纤维素分解酶浓度低，分解纤维素等物质的速度缓慢，WSC浓度低，乳酸菌繁殖速度慢，pH 下降速度慢，DM 分解时间长，WSC消耗少[17]，这与乳酸浓度相吻合。研究结果还显示，添加纤维素分解酶可以降低凤梨渣青贮饲料中CF 含量，显著降低NDF 含量，提高RFV，这些均与前人[15-20]研究结果一致，也进一步说明纤维素分解酶对植物细胞壁具有溶解作用，添加纤维素分解酶有助于降低凤梨渣青贮饲料中纤维物质含量，进一步提高青贮品质。

3.2 发酵时间、纤维素分解酶添加量对凤梨渣青贮饲料干物质降解率的影响

本研究结果显示，纤维素分解酶添加水平和瘤胃发酵时间的差异达到极显著水平，说明纤维素分解酶添加水平和瘤胃发酵时间对DMD 影响差异极显著，有必要进一步对瘤胃发酵时间和纤维素分解酶添加水平进行研究。Anusorn等[12]研究表明，纤维素分解酶可以提高肉牛瘤胃菌群丰度，提高DMD；纤维素分解酶处理后可以提高湘东黑山羊、奶牛对头季再生稻青贮饲料[14]、豆渣与桑叶混合青贮饲料[15]的养分利用率；冯鹏等[19]研究也表明，纤维素分解酶处理玉米秸秆后进行青贮，可以提高肉羊对玉米秸秆青贮饲料的养分利用率；丁浩等[20]通过纤维素分解酶处理象草后进行青贮，也得出纤维素分解酶可以改善青贮饲料的青贮品质，进而提高动物对青贮饲料中养分的利用率。本研究结果得出，随着发酵时间的延长DMD 呈上升趋势，且上升速度逐步趋于平缓，这与前人[15-16]研究结果是一致的。纤维素分解酶添加组的干物质降解率均高于对照组，体外发酵4 h，纤维素分解酶添加组的DMD均显著高于对照组，体外发酵6 h，Ⅲ组的DMD 显著高于对照组，这与前人[12,14-16,19-20]研究结果也是一致的。其主要原因是青贮饲料经青贮后，青贮原料表面角质层遭到破坏，从而提高动物对养分的利用效果[17]，同时由于纤维素分解酶可以破坏植物细胞壁，进一步破坏青贮饲料表层的细胞壁，进而分解内部部分纤维物质，降低纤维物质密度，从而使瘤胃微生物更好的与营养物质接触，提高对养分的消化利用效率[20]。

3.3 凤梨渣青贮饲料养分、青贮指标和干物质降解率的相关性分析

根据本研究结果可以看出，瘤胃发酵前期（≤24 h），DMD 主要受CP、LA、AA、PA、TVFA、LA/TVFA、NH3-N、NH3-N/TN、NDF、RFV 的影响，其中，CP、LA、AA、PA、TVFA、LA/TVFA、RFV 与DMD 呈显著或者极显著正相关关系，NH3-N、NH3-N/TN、NDF与DMD呈显著或者极显著负相关关系；瘤胃发酵后期（＞24 h），DMD 主要受LA、AA、PA、TVFA、RFV 的影响，且均与DMD 呈显著或者极显著正相关关系。可以得出，纤维素分解酶对凤梨渣青贮饲料DMD 的改善主要依靠增加凤梨渣青贮饲料中CP、LA、AA、PA、TVFA、LA/TVFA、RFV 或者降低NH3-N、NH3-N/TN、NDF 来实现。研究指出，CF 含量与青贮饲料的DMD 呈负相关[17,20]，本研究也得出相同结论，但是相关性未达到显著水平，其原因是凤梨渣青贮饲料相较于青贮玉米等禾本科青贮饲料，其CF 含量较低。NDF 与反刍动物唾液分泌、反刍和瘤胃正常蠕动和微生物组成密切相关，是不被动物消化或者很难消化的一类物质。当日粮中NDF 含量超过25%时，随着NDF 水平的上升，干物质采食量（DMI）降低，从本实验结果可以看出添加纤维素分解酶可以促进微生物对NDF 的降解，进而提高RFV，与前人[17,19-20]研究结果一致。pH、CP、NH3-N是衡量青贮饲料品质好坏的重要指标，一般来说pH 越低CP 保存越好，NH3-N 浓度越低。当pH 过高时，腐败菌将CP 分解为胺、氨等易挥发物质，从而提高青贮饲料中NH3-N 浓度，这部分NH3-N 大部分会通过挥发损失掉；反之，当pH 降至一定范围时，可抑制有害菌繁殖，减少腐败菌对CP 的分解，让更多CP 进入瘤胃，被细菌分解为瘤胃NH3-N，供瘤胃微生物合成菌体蛋白。Anusorn等[12]研究表明，纤维素分解酶处理后可以提高青贮饲料CP、降低NDF，增加瘤胃微生物的丰富度，提高DMD，邹诗雨等[14]、赵超等[15]、丁浩等[20]研究结果也表明纤维素分解酶可以提高青贮饲料CP、降低NDF进而提高瘤胃对营养物质的降解率，这些都与本试验研究结果一致。

4 结论

纤维素分解酶可提高凤梨渣青贮饲料中CP、LA、AA、PA、TVFA、LA/TVFA、RFV 含量，降低NH3-N、NH3-N/TN、CF、NDF、ADF 含量和pH；纤维素分解酶添加水平和瘤胃发酵时间与干物质降解率呈极显著正相关关系；瘤胃对凤梨渣青贮饲料的干物质降解率与CP、LA、AA、PA、TVFA、LA/TVFA、RFV 含量呈正相关关系，与NH3-N、NH3-N/TN、NDF 呈负相关关系。综上，纤维素分解酶可以提高凤梨渣青贮品质和干物质降解率，以1 500～3 000 u/kg添加量为宜。

致谢：广东省科技专项资金（“大专项”+“任务清单”）（2020A03025、2021A05209）同时对本研究给予了资助，谨致谢意！