不同密度聚氨酯海绵为支撑物的液体悬浮培养对蝴蝶兰组培苗生长的影响

郑秋桦 黎栋然 潘烨鑫 郑翼泽 吴京圩

（1.韶关学院英东生物与农业学院，广东 韶关 512005；2.韶关市绿沃农业科技有限公司，广东 韶关 512005）

0 引言

蝴蝶兰是对兰科蝴蝶兰属植物的总称，其花形酷似蝴蝶，典雅细腻，被誉为“洋兰皇后”，深受广大消费者的青睐。蝴蝶兰是我国销售量最高的年宵盆花花卉，也是国际畅销的盆花种类［1］。作为单茎性气生兰，蝴蝶兰的自然繁殖相对较困难，增殖速度也相对较慢［2］。随着市场需求的增长，研究蝴蝶兰的组织培养技术显得尤为重要［3-6］。

目前，蝴蝶兰的组织培养多用琼脂粉作为固化剂，琼脂粉由琼脂糖和琼脂果胶组成。由琼脂粉制成的琼脂具备胶质感，色泽由白到微黄，没有气味或者有轻微的气味。琼脂不含营养，不能为植株补充营养物质，且其本身作为一种固化剂含有对植物有毒的物质；植株生长过程中，根系深入琼脂，影响根细胞呼吸；植物组织在代谢过程中会产生对植物有害的物质，如果此类物质不能及时排出，将影响植株生长。由此可见，用固体培养基进行组培苗培养存在不少问题，而液体培养可以避免这些问题［7］。但液体培养组培苗需要有支撑物保证组培苗直立、正常生长，故此次开展基于静止液体培养法（又称滤纸桥法），在漂浮培养、浅层液体培养条件下，以聚氨酯海绵作为支撑物的液体悬浮培养试验［7］。

笔者选择聚氨酯海绵作为支撑物是由于琼脂粉成本较高，且不能重复利用，而聚氨酯海绵可以重复利用。试验以蝴蝶兰组培苗为试验材料，探究以不同密度聚氨酯海绵为支撑物的条件下，不加琼脂粉固化，液体悬浮培养对蝴蝶兰组培苗生长的影响。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为蝴蝶兰增殖阶段瓶苗，由英东生物与韶关学院英东生物与农业学院植物组织培养实践教学提供，品种为宝贝和绿熊。

固体培养基为1/3MS+蔗糖2.0%+蛋白胨0.2%+马铃薯粉3.0%+苹果2.0%+香蕉3.0%+NAA1.0 mg/L+活性炭0.2%，在pH值5.8的条件下加入琼脂粉0.5%制成固体培养基；液体培养基则不加入琼脂粉。

每个聚氨酯海绵模具的直径为80 mm，厚度为20 mm。以圆心向周边扩散，均匀分布30个大小一致的孔。孔通过高温加热金属棒来熨烫，每个孔直径为5 mm、深度为10 mm。

1.2 试验设计

1.2.1 试验方法。使用500 mL培养瓶，每瓶加入100 mL培养液和聚氨酯海绵模具，蒸汽灭菌后备用。在无菌条件下的超净工作台，待组培苗长到2 cm左右，用高温消毒的镊子和解剖刀将组培苗剪成单芽，转入壮苗培养基。试验共接种两个品种的蝴蝶兰，每组用高密度聚氨酯海绵（50PPI1）和低密度聚氨酯海绵（25PPI）各重复2瓶，每瓶接种20个单芽，共2组，每组接种1瓶固体培养基作为对照，经过接种的培养瓶放在温室中持续培养。培养室温度调整为27 ℃，光照度1 500～2 500 lx，每天光照12 h，持续培养30 d。

1.2.2 试验结果统计。30 d后观察记录试验组和对照组的平均生根情况及幼苗长势，并分别对组培苗的根长度、根质量、植株高度和单株鲜质量（除根）进行测定，采用单因素方差分析法分析。

2 试验结果与分析

2.1 不同培养基对蝴蝶兰组培苗生长的影响

在不同培养基下，蝴蝶兰宝贝和蝴蝶兰绿熊的形态不一（见图1和图2）。在聚氨酯海绵液体悬浮培养体系下，蝴蝶兰组培苗叶片翠绿、直立挺拔、根系粗壮。在固体培养基下，蝴蝶兰组培苗部分叶片枯萎、根系细长。结果表明，对于蝴蝶兰组培苗的培育，液体悬浮培养要优于固体培养。

图1 蝴蝶兰宝贝在不同培养体系中生长状况对照

图2 蝴蝶兰绿熊在不同培养体系中生长状况对照

2.2 不同密度聚氨酯海绵对蝴蝶兰组培苗生长的影响

2.2.1 组培苗的生长情况。在短周期培养30 d的情况下，聚氨酯海绵液体悬浮培养体系和固体对照组的生根率都达到100%，而且根的平均长度相差不多，但是根质量和单株鲜质量（除根）存在明显差别。由表1和表2可知，高密度聚氨酯海绵液体悬浮培养蝴蝶兰效果更佳。

表1 蝴蝶兰宝贝组培苗的生长情况

表2 蝴蝶兰绿熊组培苗的生长情况

2.2.2 单因素方差分析。通过方差分析，尽可能减小试验误差。由表3可知，蝴蝶兰宝贝的根质量单因素方差分析，组间P值＜0.05，拒绝原假设，证明培养基类型对于其根质量有显著影响。由表4可知，蝴蝶兰宝贝的单株鲜质量单因素方差分析，P值＜0.05，拒绝原假设，培养基类型对其单株鲜质量显著影响。由表5绿熊根质量单因素方差分析可知，P值＜0.05，拒绝原假设，说明培养基类型对植株根质量有显著影响。由表6绿熊单株鲜质量单因素方差分析可知，P值＜0.05，拒绝原假设，因此可判断培养基类型对植株单株鲜质量有显著影响。

表3 单因素方差分析（宝贝根质量）

表4 单因素方差分析（宝贝单株鲜质量）

表5 单因素方差分析（绿熊根质量）

表6 单因素方差分析（绿熊单株鲜质量）

3 结论与讨论

试验表明，在30 d的短周期培养中，聚氨酯海绵液体悬浮培养能够有效提高蝴蝶兰根质量和植株质量，且高密度聚氨酯海绵的效果更佳。在固体培养基中，由于接种操作不当或组培苗本身因重力作用，接种时或是接种后不久，组培苗可能会下陷没入培养基，缺氧致死的情况常有发生，培养基在后期也会出现因组培苗代谢产物聚集变黑的情况。而在液体悬浮培养体系中，虽然水分比较充足，但因为有聚氨酯海绵作为支撑物，并不会出现接种苗因不能进行呼吸作用而死亡的现象。液体培养与固体培养对比，具有操作简单方便、成本低的优点，且液体培养更有利于培养材料对营养的吸收［8］。

聚氨酯液体悬浮培养体系对于蝴蝶兰组培苗的壮苗效果要明显优于固体培养基。在液体悬浮培养体系中，效果最佳时，蝴蝶兰宝贝的根质量是固体对照组的1.53倍，单株鲜质量（除根）则是固体对照组的1.70倍；同样，蝴蝶兰绿熊根质量是固体对照组的1.49倍，单株鲜质量（除根）则是固体对照组的1.38倍。试验结果表明，在以高密度聚氨酯海绵作为支撑物的培养基中，组培苗的高度比以低密度聚氨酯海绵作为支撑物的培养基培养的植株高。在低密度聚氨酯海绵中生长的组培苗，生根时易插入海绵的孔径中（见图3），对组培苗移出增加了难度，易造成根部损伤，用力过度时根部会断在海绵孔径中，使用高密度的聚氨酯海绵则不易出现以上情况。综上所述，用高密度的聚氨酯海绵作为支撑物进行组培苗培养效果更佳。

图3 蝴蝶兰组培苗生根插入低密度海绵孔径

此次试验旨在建立一个稳定、操作方便且低成本的蝴蝶兰组培苗液体培养系统，但在试验过程中，笔者发现存在以下几个问题。一是试验所用的聚氨酯海绵模均为人工制模，耗时时间长，且模具打的每个孔会受人为因素影响存在差异，因此需要解决如何批量制模且保证制作的模具大小一致的问题。二是试验中，部分蝴蝶兰组培苗根茎在生长时插入聚氨酯海绵里，组培苗与海绵模具交缠在一起，导致其不能被拔出，用力过度时，蝴蝶兰组培苗根茎会断裂在聚氨酯海绵里。该现象一般在低密度的聚氨酯海绵中发生，正确选择模具（高密度聚氨酯海绵）能帮助避免出现此类问题。