杆状病毒miRNA研究进展

方 正

(贵州师范大学生命科学学院，贵州 贵阳 550001)

前言

MicroRNA(miRNAs)是一类主要由内源基因编码的，长度约为18～25nt的非编码单链小分子RNA[1]。2003年首个miRNA(lin-4)在秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegan)中被证实通过抑制lin-14蛋白表达导致线虫跃过L1期并直接进入L2发育期及发育后期[2]，从而开启了miRNA的研究热潮。随着学者对人类、动物、植物等的深入研究,发现miRNA在肿瘤发生、生物发育、抗病毒、宿主免疫、表观调节以及代谢方面有着重要的调控作用，且已在动物、植物和病毒等中发现大量的miRNA[3]。由于miRNA的尺寸小、占据相对较小的基因组空间、甚至可能是非免疫原性的,且特异地调控靶基因的表达，因此病毒miRNA(病毒编码的miRNA)可作为病毒抵御宿主免疫的有力武器[4]。MiRNA主要通过抑制靶基因mRNA翻译或促进mRNA降解，在转录后水平实现对靶基因表达的负调控[3]。

杆状病毒(Baculovirus)是一类具有杆状核衣壳的双链DNA病毒，具有嚢膜包裹，其整个生命周期会产生出芽型病毒(budded virion，BV)和包涵体衍生型病毒(occlusion-derived virion，ODV)2种形态的病毒粒子，分别具有不同的生物学意义[5]。杆状病毒的宿主范围包括鳞翅目、膜翅目和双翅目等昆虫，是自然环境中昆虫种群和数量的重要调节因子[6-10]。因此，其对农业害虫防治具有重要的研究应用价值，已被开发为生物杀虫剂广泛应用于农林害虫的生物防治。但有关杆状病毒编码的miRNA研究起步较晚，相关参考资料较少。本文综述了杆状病毒miRNA的发现与鉴定及其生物学功能，旨在为杆状病毒miRNA进一步研究提供参考。

1 杆状病毒miRNA的发现与鉴定

迄今为止，已对超过200个杆状病毒全基因组进行测序并提交到NCBI数据库中。然而，与疱疹病毒编码的200多个miRNAs的功能研究相比[4]，杆状病毒编码的miRNAs的研究仍处于起步阶段。2010年Singh等结合小RNA测序、生物信息学分析、茎环PCR和Northern blot等手段证实在家蚕核多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)感染的家蚕幼虫体内存在4个BmNPV miRNAs[6]，这也是首次发现杆状病毒miRNA。Zhu等于2013年通过生物信息学预测、RT-PCR和Norther nblot在苜蓿芽纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)中鉴定到一个AcMNPV miRNA(AcMNPV-miR-1)[7]，随后其又通过小RNA测序鉴定到更多的AcMNPV miRNA[8]。Kharbanda等通过小RNA测序在斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus，SpltNPV)感染的Sf21细胞中发现有48个SpltNPV miRNA[9]。Ferrelli通过生物信息学分析大豆夜蛾核多角体病毒(Anticarsia gemmatalis nucleopolyhedrovirus AgMNPV)中预测到与BmNPV-miR-4同源的AgMNPV miRNA序列，并进一步利用Northern blot实验手段在AgMNPV感染的High Five细胞中得到证实[10]。

目前，在杆状病毒miRNA的研究中常用的手段是生物信息学预测、茎环PCR、RT-PCR、Northern blot和小RNA测序等技术手段。截至2022年11月，文献报道仅在BmNPV、AcMNPV、SpltNPV和AgMNPV 4个杆状病毒中鉴定到miRNA，随着分析手段的不断完善和研究的不断深入，相信在不久的将来会有更多的杆状病毒miRNA被揭示。

2 杆状病毒miRNA的作用机制

部分DNA病毒miRNA和真核miRNA一样通过经典途径合成，由Drosha和Dicer(即Drosha-Dicer方式)加工处理产生成熟体发挥功能。如乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)HBV-miR-3是通过经典的Drosha-Dicer方式合成[11]。但某些病毒miRNA的生物合成不依赖上述经典途径，如鼠γ-疱疹病毒68(Murine gamma-herpesvirus 68，MHV68)pri-miRNA是由位于相邻病毒转运RNA(transfer ribonucleic acid，tRNA)样序列内的RNA pol III启动子转录，产生串联tRNA发夹结构，得到的5tRNA部分的pri-miRNA不经Drosha处理，而是由宿主tRNase Z切割tRNA结构的下游，释放pre-miRNA发夹结构，然后由Dicer处理产生成熟的miRNA[11]。在杆状病毒中，BmNPV miRNA是由经典的真核miRNA生物合成途径合成的，见图1[3]，但其它的杆状病毒miRNA生物合成方式目前尚不清楚。

图1 BmNPV miRNA生物合成及其对靶基因的调控方式[11]

作为1种基因表达调控因子，miRNA调控靶基因表达的方式主要有2种，通过与靶基因mRNA 3′UTR完全互补结合，降解其mRNA，从而降低靶基因的表达，见图1；miRNA通过不完全结合靶基因的mRNA 3′UTR，然后抑制靶基因的蛋白翻译，最终实现对靶基因的负调控[12]。随着miRNA研究的不断深入及越来越多miRNA从各种生物中发现，研究人员发现，miRNA不仅能通过结合靶基因mRNA的3′UTR，而且能够通过结合靶基因mRNA的5′UTR和CDS区进行基因的转录后调控[13]。此外，1个miRNA可以调控多个靶基因，1个靶基因也可能受到多个miRNA的调控，形成一个调控网络，最终实现复杂的生物学调控[1]。

杆状病毒miRNA的作用方式也是多样的，如AcMNPV-miR-1通过靶向自身及基因ODV-E25的CDS区并诱导mRNA的降解，进而减少BV的产生并促进ODV的形成。同时，AcMNPV-miR-1还可以靶向调控自身基因ac18和ac95[14]。BmNPV-miR-3可与BmNPV P6.9 mRNA的3′UTR完全互补，并负调控P6.9的表达，从而促进BmNPV的感染[15]。但还没有杆状病毒miRNA通过结合到靶基因的5′UTR来调控基因表达，以及多个病毒miRNA靶向同一靶基因的相关研究，这可能由于杆状病毒miRNA研究较少，许多作用机制还待揭示。

3 杆状病毒miRNA的生物学功能

病毒miRNA通过调节与病毒感染相关的多种生物学过程，包括宿主凋亡、免疫逃避、病毒感染周期等，促进病毒在宿主中复制增殖，使病毒能在宿主细胞中存活[15,16]。如疱疹病毒(Epstein barr virus，EBV)EBV-miR-BART2可以完全互补靶向自身的DNA聚合酶基因，负调控DNA聚合酶蛋白的合成并抑制潜伏感染EBV的激活[16]。在猴病毒40(Simianvirus40，SV40)miRNA在病毒复制晚期表达，并靶向降解SV40 T抗原的转录本，使SV40免受T淋巴细胞清除[17]。

杆状病毒miRNA通过调控自身基因的表达来逃避宿主免疫或促进病毒感染。在昆虫系统中，酚氧化酶原、丝氨酸蛋白、Hemolin等在先天免疫反应中发挥重要作用，Hemolin作为鳞翅目特有的模式识别蛋白，参与抗病毒活性，如血细胞聚集、结节形成和吞噬[18]。BmNPV miRNAs预测靶基因包括家蚕丝氨酸蛋白酶、Hemolin和酚氧化酶原等宿主抗病毒蛋白[6]。因此，可以推断BmNPV miRNAs通过靶向负调控这些宿主先天免疫相关蛋白的表达，这可能是杆状病毒逃逸宿主免疫应答的一种有效策略。BmNPV P6.9作为病毒组装的必需蛋白，但不影响病毒复基因，BmNPV-miR-3通过与P6.9的3′UTR完全互补的方式抑制P6.9表达，从而减少感染早期病毒载量，使BmNPV逃避宿主早期免疫[15]。此外，BmNPV-miR-3还能与p40、p95、极晚期因子1(vlf1)、fusolin、chitinase、bp15和lef-8结合，抑制其表达，延迟病毒成熟，有利于病毒自身逃避宿主免疫清除[3]。过表达AcMNPV-miR-1会降低出芽型病毒粒子BV的感染性，促进多角体的感染[14]。

杆状病毒miRNA通过全局调控宿主miRNA表达。Export-5作为Ran GTPase结合蛋白家族的一员，是miRNAs等小RNA从细胞核转运到细胞质中的关键蛋白，并依赖于Ran GTP，Ran是export-5介导的核质转运机制的重要组成部分，BmNPV-miR-1通过靶向负调控Ran抑制宿主miRNA的合成，在细胞水平或虫体水平显著提高了BmNPV的病毒载量[19]。

4 杆状病毒miRNA在持续性感染中的作用

持续性感染是指能够形成长期感染而不被宿主免疫反应清除，持续感染的能力对于促进病毒的传播至关重要，且杆状病毒持续感染现象普遍[20]。病毒潜伏期是一种持续性感染形式，感染细胞不会产生任何病毒子代，病毒基因转录但不翻译成蛋白质。研究表明，这些潜伏感染状态病毒基因的转录本通过编码miRNA调控基因表达来建立潜伏感染，如在棉铃虫裸病毒(Helicoverpa zea nudivirus，HzNV-1)潜伏感染的草地贪夜蛾、粉纹夜蛾等昆虫细胞中，仅转录一个与持续性感染相关转录因子1(persistence associated gene 1，pag1)，随后证实HzNV-1 pag1编码的多个miRNAs通过抑制早期基因-hhi1的表达，建立了潜伏感染，抑制pag1编码的miRNAs可以将潜伏感染的HzNV-1激活为裂解性感染[21]。几乎所有的人类疱疹病毒都编码抑制自身早期基因IE表达的病毒miRNA，以此调节病毒的裂解性感染和潜伏感染[16]。杆状病毒潜伏感染状态下亦转录部分病毒基因，但不表达病毒蛋白[22]。在甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodoptera exigua multicapsid nucleopolyhedrovirus，SeMNPV)潜伏感染的甜菜夜蛾细胞中转录了至少16个病毒基因，但未检测到病毒蛋白的表达[23]，这些病毒基因是否以非编码RNA的形式调控宿主或自身基因表达来建立和维持潜伏感染还需要研究。

5 展望

杆状病毒miRNA在过去的10a中得到了越来越多的关注，这一领域的研究不断扩大了人们对杆状病毒与宿主相互作用的认知。但与其它病毒miRNA相比，杆状病毒miRNA仍有许多未知领域有待进一步研究：新的杆状病毒miRNA及其靶基因鉴定，从NCBI数据库可知已有超过200个杆状病毒完成全基因组测序，但有miRNA相关研究的杆状病毒只有BmMPV、AcMNPV、SpltNPV 和AgMNPV;杆状病毒miRNA在解性感染和持续感染转换中的作用，病毒miRNA在病毒持续性感染建立过程中具有重要作用，杆状病毒持续感染现象也普遍存在，但杆状病毒miRNA是否参与持续性感染的建立以及激活还不清楚;杆状病毒miRNA的其它生物学功能探索，现有研究表明病毒miRNA的生物学功能丰富多样，但目前有关杆状病毒miRNA的生物学功能研究主要集中在调控宿主免疫基因和自身基因以促进病毒复制；杆状病毒miRNA对宿主代谢、抗逆性和发育等方面是否具有调控作用尚不清楚，这也可能是今后的研究方向。