猪圆环病毒2型分子流行病学研究进展

高小鹏，罗胜军，徐 麟，王泽岩，高 原，向 华，陈 晶，黄 元，白挨泉*，王晓虎*

(1.佛山科学技术学院 生命科学院，广东 佛山 528225；2.广东省农业科学院 动物卫生研究所，广东 广州 510640；3.视频兽医网，吉林 长春 130062；4.珠海市启信达生物科技有限公司，广东 珠海 519031)

猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2，PCV2)是严重影响全球养猪业经济效益的重要疫病之一，感染家猪与野猪外，还在反刍动物、啮齿动物、犬科动物、昆虫和其他非猪物种中发现潜在的PCV2病毒[1]。临床上，PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎和肾病综合征、新生仔猪先天性震颤、母猪繁殖障碍、猪增生性坏死性肠炎、肺炎[2]等症状的主要病原。PCV2感染可以导致宿主淋巴细胞损耗和免疫抑制，使其对其他病毒更易感[3]，因此，宿主体内往往存在双重甚至多重共感染：多种PCV2基因型、PCV3及其他猪源病毒间(猪繁殖与呼吸综合征病毒、病猪细小病毒、古典猪瘟病毒、猪流感病毒、伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒等)的共感染[4]。20多年的流行，PCV2核衣壳基因的高核苷酸替代率已导致多种基因型的存在[5]，虽然商品化的兽用疫苗已广泛使用，有效降低了宿主感染后的亚临床症状[6]，减少了养殖场的经济损失；但更多的证据表明，尽管使用PCV2灭活疫苗免疫，临床的抗原阳性率仍然较高[7]，其中2014—2016年，我国PCV2的抗原阳性率高达64.68%(n=235)。目前，商用PCV2疫苗主要基于PCV2a基因型，近年来由于PCV2的抗原变异，疫苗已不能完全保护宿主抵抗感染[8]。因此，为了解PCV2在我国的流行及其遗传进化趋势，本研究总结统计了2010—2020年间我国各地区PCV2的分子流行病学数据，这为我国PCV2分子流行学情况提供了具体数据，以期对我国PCV2的防控提供一定借鉴和指导意义。

1 病原学

PCV2为单股负链无囊膜正二十面体对称的DNA环状病毒。全基因组有1 766～1 769个核苷酸，预测有11个重复的开放阅读框(open reading frame，ORF)[9]，即ORF1～ORF11，但只有ORF1～ORF6被正确表征：ORF1编码2个复制相关蛋白(Rep and Rep′)，ORF2编码参与宿主免疫应答的衣壳蛋白(Cap)，ORF3与ORF4分别编码凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，ORF5编码新型潜在内质网应激诱导蛋白，ORF6编码一种新发现的蛋白质，该蛋白质可能参与了胱天蛋白酶的调控以及PCV2感染细胞中多种细胞因子的表达[10]。其中，ORF2是病毒衣壳的唯一组成部分，参与病毒附着是宿主免疫反应的主要靶标；由于缺少病毒包膜，Cap蛋白被暴露在病毒体表面，具有显著的遗传多样性，Cap蛋白可作为PCV2流行病学及其基因分型鉴定的靶标基因序列[11]。

2 分子流行病学研究进展

2.1 PCV2基因分型20世纪90年代，PCV2从美国和欧洲具有断奶仔猪多系统衰竭综合征症状的猪场中被发现，与其他ssDNA病毒类似，PCV2具有高突变率特征。2008年，GRAUROMA等[12]基于不同ORF2核苷酸多样性分析后，以遗传距离3.5%的临界值，定义了最初的2个基因型PCV2a和PCV2b；同时，DUPONT等[13]通过对丹麦PCV2的ORF2进行回顾性调查发现，45个样本的PCV2基因组核苷酸序列具有99.4%～100.0%的同源性，随后被命名为PCV2c(EU148506和EU148507)。2010年，LONG等[14]通过分析多个地区的分离株，首次在我国发现并命名了新基因型PCV2d(HM038031、HM038030和HM038017)，基因组为1 766～1 767 nt，并确定了从PCV2a(HM038034)到PCV2b(HM038018、HM038022和HM038029)的转变，且PCV2b在我国占据流行主导地位。2015年，在墨西哥和美国的猪中检测到的一种新型PCV2的全基因组序列，编码Cap蛋白的ORF2序列为717 nt，比以往报道的基因型(702～705 nt)相比3′端增加了12 nt，并被命名为PCV2e(KT795288、KT795289和KT7952-90)[15]。2017年，我国的一项回顾性研究，通过对1996—1999年间收集的23株PCV2毒株ORF2序列比对显示，其中20株为PCV2a(MF139068、MF139071和MF139073)，其余3个毒株为1个独立进化枝，被命名为PCV2f(MF139078、MF139076和MF139077)[16]。在另一项回顾性研究中，FRANZO等[17]提出了一个以系统发育树为基础的基因型定义，设立了以下3个标准：同一基因型内最大P距离为13%(根据ORF2基因计算)；相应内部节点的bootstrap应高于70%，至少有15个可用序列。基于此对2018年7月之前上传的4 586个ORF2有效序列使用邻接法进行比对分析，可分为8个基因型，包含新定义的PCV2g(AY713470.1、DQ363860.1和JX099786.1)和PCV2h(AY035820.1、JN411098.1和MF314300.1)。

目前，我国传播的主要基因型为PCV2a、PCV2b和PCV2d，且PCV2d取代PCV2b成为未来的主要基因型。商品化的疫苗已广泛应用，也均具有一定的保护性，能够有效控制临床症状的进一步发展，减少病毒血症、病毒感染和传播[18]，形成有效的体液和细胞免疫应答，但却不能完全阻止病毒在宿主体内复制[19]，PCV2的实验室诊断，抗原抗体同时检测才更有意义。攻毒试验表明，各基因型间虽然具有免疫交叉保护，但是，与异源基因基因型攻击相比，疫苗对同源攻击的保护作用更高[20]。因此，对于近些年PCV2不同基因型间的迁移产生应该引起足够重视。

2.2 PCV2基因型分析对上述PCV2全基因序列使用MEGAX进行分析。各基因型间ORF2的同源性在80.34%～95.47%之间，全基因同源性在90.20%～96.82%之间，不同基因型间ORF2的同源性差异更大，更适合基因分型鉴定。其中，Neighbor-Joining计算P距离进行系统发育树分析(图1)，全基因与ORF2的基因分型结果基本符合。 相比PCV2a-PCV2e分型，图1B基于ORF2的系统发育树，PCV2f/h与PCV2b在同一分支，而PCV2a被包含在PCV2c中，这是PCV2基因分型方法学不断更新的表现，因而PCV2基因分型方法中选择更新的标准毒株，系统发育树才更可靠。

A.基于全基因的系统发育树；B.基于ORF2的系统发育树

2.3 我国PCV2分子流行病学为评估我国PCV2的抗原阳性率，通过知网与PubMed，收集整理国内外2010—2020年间37篇调查报告(表1)。共计13 226份样品，7 012份核酸阳性，PCV2阳性率53.02%；涉及1 308株PCV2基因型，其中PCV2a(13.61%)，PCV2b(59.79%)，PCV2d(29.51%)，PCV2e(0.46%)。

表1 我国PCV2分子流行病学调查汇总 份

续表1

为研究我国PCV2分子流行病学以及各基因型遗传进化的时空分布，根据我国行政区域划分(可分为8个地区)。由图2可知，2010—2015年间，港澳台PCV2(46.55%)的阳性率最低，而西南、西北和华南(72.79%，82.98%和86.29%)地区的阳性率较高；2016—2020年间，西北(17.30%)地区的阳性率最低，其他地区的PCV2阳性率都有所下降。

图2 2010—2020年间我国各地区PCV2抗原阳性率

此外，PCV2具有很高的进化率(1.2×10-3取代数/位点/年)[58]，我国2010—2015与2016—2020年间不同PCV2基因型相比(图3)，现阶段PCV2b与PCV2d已成为各地区的主要基因型，2010—2015年间PCV2b是主导基因型，而2016—2020年间在除华北以外的地区，PCV2d已取代PCV2b成为主导基因型，PCV2a则显示较少的检出率。我国2010—2015与2016—2020年间各地区中，东北地区PCV2a占比率由14.09%升至15.56%，PCV2b由83.89%降至31.11%，PCV2d由2.01%升至53.33%；在港澳台地区，2016—2020年间PCV2a占比率为1.52%，2010—2015年间PCV2b为25.53%，PCV2d由74.47%升至98.48%；在华北地区2010—2015年间PCV2a占比率为13.33%，PCV2b由26.67%升至60.98%，PCV2d由60.00%降至31.71%，2016—2020年间PCV2e为7.32%；在华东地区PCV2a由13.74%升至14.08%，PCV2b由73.80%降至43.66%，PCV2d由14.38%升至53.52%；在华南地区PCV2a由12.82%降至8.33%，PCV2b由23.08%升至39.58%，PCV2d由56.41%降至52.08%，2010—2015年间PCV2e占比率为7.69%；在华中地区2016—2020年间PCV2a占比率为5.77%，PCV2b由25.00%升至34.62%，PCV2d由75.00%降至55.77%；在西北地区2010—2015年间PCV2a占比率为49.57%，PCV2b由82.05%降至55.00%，2016—2020年间PCV2d占比率为45.00%；在西南地区2016—2020年间PCV2a占比率为4.76%，PCV2b由100%降至9.52%，2016—2020年间PCV2d占比率为85.71%。

图3 2010—2020年我国各地区不同PCV2基因型占比率

3 小结

PCV2作为一种普遍存在的病毒，特别是在猪场中妊娠分娩区域广泛存在[59]。当前商品化疫苗的广泛使用使PCV2发病率和病毒血症水平都有所下降[60]，但亚临床感染以及新基因型的出现仍备受重视。本文通过统计近十年间我国PCV2阳性率及各基因型的时空分布，证明：首先，我国PCV2阳性率处于整体下降趋势；PCV2d逐步取代PCV2b成为优势毒株；其次，不同地区的PCV2基因型占比中，华北与西北地区均无PCV2a检出，PCV2b我国大部分区域(除港澳台外)则都有检出，其中，港澳台与西南地区的PCV2d检出率最高；再次，PCV2e仅在华南及华北少量分布。

自2000年首次报道PCV2以来[61]，我国经历了3次基因型转变，2000—2003年主要为PCV2a，2003年之后逐步从PCV2a到PCV2b，2012年之后从PCV2b到PCV2d。此外，我国PCV2a/b/d具有明显的时空分布特征与规律，并受到宿主间个体差异、不良的控制措施及毒力(PCV2多种基因型如疫苗免疫与野毒共存)的影响及内外部环境(猪场间引种或跨宿主传播即周边非猪源的蝙蝠、啮齿类动物及吸血昆虫所携带的致病性PCV2病原)的威胁，而重组出更多的PCV2变体[62]。因而，猪场PCV2的防控，受到其丰富的遗传多样性影响而面临巨大挑战，为应对可能出现的威胁，通过持续的流行病学监测，掌握PCV2流行毒株的时空分布，对我国养猪业的健康发展具有重要意义。