广东地区1株猪非典型瘟病毒的鉴定及遗传演化分析

侯展鹏，陈文俊，林佩仪，梁 宇，刘文俊，曹 楠，许丹宁，田允波，黄运茂*，付新亮*

(1.仲恺农业工程学院 动物科技学院，广东 广州 510225； 2.广东省水禽健康养殖重点实验室，广东 广州 510225)

猪非典型瘟病毒(atypical porcine pestivirus，APPV)属于黄病毒科瘟病毒属，为单股正链 RNA 病毒，病毒粒子无囊膜结构。该病毒属还包括猪瘟病毒(CSFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、边界病病毒(BDV)以及一些尚未明确分类的瘟病毒[1]。APPV 基因组全长约为11 kb，包含5′和3′非编码区以及编码多聚蛋白的开放阅读框(ORF)，其中 ORF 长度为10 908 bp，编码4种结构蛋白(C、Erns、E1、E2)以及8种非结构蛋白(Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B)[2-4]。E1、E2、Erns分别是3种囊膜糖蛋白，E1蛋白与 E2蛋白在病毒表面形成异二聚体，对病毒进入细胞具有至关重要的作用[5]，其中 E2蛋白是 APPV 的主要的结构蛋白及保护性抗原，E2蛋白具有多个抗原位点，可以诱导机体产生中和抗体[6]。与 CSFV 相似，APPV 的 E2基因变异最为明显[7-8]。

2015年，HAUSE 等[2]首次在美国猪群鉴定到1种新型的APPV，随后 ARRUDA等[9]将 APPV 阳性血清接种胎儿，证实了 APPV 是引起仔猪先天性震颤(congenital tremor,CT)的主要病原。临床上患有 CT 的仔猪可出现局部或全身性有节律震颤，导致病猪因无法站立、吮乳受阻，逐渐消瘦、甚至死亡，病死率高达30%[10-11]。目前，APPV 在全球范围内广泛流行，我国于2016年首次在广东发现该病毒，并且在我国多个省份猪群有 APPV 感染的报道，给我国养猪业造成巨大的潜在威胁[12]。本研究通过研究2018—2019年广东地区猪群 APPV 的流行特点及遗传变异情况，为掌握广东地区猪群 APPV 的流行本底奠定基础，同时也为 APPV 的防控及疫苗毒株的筛选提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料采集2018—2019年，从广东地区4个发病猪场采集 12份疑似 CT 的病料组织(脑、肺脏、肾脏、脾脏和淋巴结)，并保存于 -80℃，用于 APPV 的检测。

1.2 主要试剂TRIzol 总 RNA 提取试剂购自美国 Thermo Fisher 公司；Prime STAR®HS DNA Polymerase、M-MLV 反转录试剂盒、pMD18-T 载体、DL2000 DNA Marker 购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA 凝胶回收试剂盒购自OMEGA 公司、Gelstain染料购自美国 GENE 公司；E.coliDH5-α感受态细胞购自北京天根生化科技有限公司；APPV 检测和全基因组扩增引物由北京六合华大基因有限公司合成。

1.3 样品处理、RNA提取及RT-PCR检测取病料组织样品加入1 mL 预冷的 PBS(含青霉素和链霉素各1 000 U/mL)充分研磨并反复冻融 3次后，8 000 r/min，4℃离心 10 min，取上清用于核酸提取。采用 TRIzol 法提取总 RNA，利用随机引物通过 M-MLV 反转录合成 cDNA，以 cDNA 为模板利用 APPV 特异性检测引物通过 RT-PCR 对 APPV 进行检测。反应条件：95℃ 5 min；95℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 10 min， PCR 产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4 全基因组测序以APPV-China/SWU-MY/2018(MH499644)为参考序列设计9对引物(表1),用于APPV全基因组扩增。经 RT-PCR 鉴定为 APPV 阳性的样品，分别利用 9对引物对其进行全基因组扩增。 PCR 扩增产物经 DNA 凝胶回收试剂盒纯化后连接至 pMD18-T 载体，并转化至 DH5-α感受态细胞，经 PCR 鉴定为阳性的重组质粒送华大基因进行测序。

表1 APPV 检测和全基因组扩增引物序列

1.5 分子特征分析及遗传演化分析经测序得到的基因序列通过 DNAStar 软件拼接，并将其ORF和E2基因与 GenBank 数据库中的参考序列进行 Blast 比对、同源性分析及氨基酸分子特征分析。进一步通过 MEGA 7.0软件分别对 APPV ORF 和 E2基因构建遗传进化树，分析目的毒株与参考毒株的遗传演化关系。

2 结果

2.1 APPV 检测及全基因组测序以提取的 12份疑似 CT 病料样品的 cDNA 为模板，经 APPV 特异性检测引物进行 RT-PCR 检测，结果显示，12份病料中有 3份样品为 APPV 阳性，其阳性率为 25%(图1A)。对其中1个阳性样品进行全基因组扩增得到1株长度为10 989 bp 的 APPV 全长序列(图1B)，命名为 APPV-China/GD-ZK/2018(GD-ZK，GenBank accession No.OL603844)。GD-ZK ORF 全长10 908 bp，编码3 636个氨基酸，其中 C、E1、E2、Erns 4种结构蛋白长度分别为110，199，241，209 aa。

A.APPV RT-PCR 检测(M.DL2000 DNA Marker；1～12.临床样品；13.阴性对照)；B.全基因组扩增(M.DL2000 DNA Marker；1～9.APPV 全基因组扩增衣壳蛋白)

2.2 同源性分析及对分子特征分析分别对 GD-ZK 与参考毒株的 ORF 和 E2基因进行核苷酸同源性分析(表2)，结果显示，GD-ZK 与参考毒株 ORF 核苷酸同源性为 80.7%～99.7%；与参考毒株 E2基因的核苷酸同源性为80.8%～99.9%，其中均与 APPV/CNYJ/2018的同源性最高。分子特征分析结果显示，GD-ZK 的 E2基因与 Genotype 2的参考毒株均有 S54T 和 S130T 2个特征性的氨基酸位点突变(图2)，因此，这2个氨基酸突变可作为 APPV 基因分型潜在的分子标记，而这些氨基酸位点突变对 APPV 抗原性及致病性的影响还需要进一步研究。

表2 GD-ZK 与参考毒株同源性分析 %

注：蓝色框内毒株为Genotype 1；红色框内毒株为Genotype 2；绿色框内毒株为Genotype 3

2.3 遗传演化分析ORF 和 E2基因遗传演化分析结果显示，GD-ZK 与 APPV/CNYJ/2018的进化关系最近，与同源性分析结果相符(图3，4)。根据遗传演化关系可将所有的 APPV 毒株划分为 Genotype 1、Genotype 2和 Genotype 3三种基因型，其中 在 ORF 和 E2基因进化树中GD-ZK株均位于 Genotype 2分支(图3，4)。Genotype 1 分支中毒株分布最为广泛，包括从中国、美国、瑞士、德国、韩国和荷兰等国家鉴定到的 APPV 毒株，而 Genotype 1和 Genotype 2两个分支中的毒株均来自中国。其中广东地区同时有 Genotype 1、Genotype 2和 Geno-type 3三个分支的毒株流行[13]，表明广东地区猪群中的 APPV 毒株具有一定的遗传多样性。

●.本研究的毒株

3 讨论

近年来，我国广东、四川、江西等多地猪群陆续出现 APPV 感染的报道[14-18]，YUAN等[10]报道 APPV 在中国南方猪群的感染率为 2.4%～20.0%，感染 APPV 的仔猪出现 CT、吮乳受阻，进而导致生长发育缓慢，病死率和淘汰率分别高达 60%,100%[19]。母猪怀孕期间感染 APPV，可引起仔猪产生免疫耐受及持续性感染，给猪场带来潜在威胁[20-23]。为了探究广东地区 APPV 的流行及遗传变异情况，本研究从广东地区疑似 CT 仔猪病料鉴定到3株 APPV，并对其中1株 GD-ZK 进行了全基因组测序。对 GD-ZK 与国内外参考毒株的 E2基因进行核苷酸和氨基酸同源性分析，结果显示，GD-ZK 与德国 Bavaria-S5/9株、朝鲜 KU16-2株、瑞士 8247株等外国参考毒株的核苷酸同源性为 80.0%～86.5%，与广东 GD-ZW 株、江西 JX-JM01株、广东 CNYJ 株等国内参考毒株的核苷酸同源性为 84.4%～97.5%，表明 GD-ZK 株与国外毒株具有较高的遗传变异。

本研究通过对 ORF 和 E2基因进行遗传演化分析，结果表明 E2基因与 ORF 基因的遗传演化关系相似，所有的 APPV 毒株可划分为 Genotype 1、Genotype 2、Genotype 3三种基因型，该结果与前期研究结果相符[24-25]，其中 Genotyp 3是 2017年发现的新基因型，说明 APPV 在不断发生变异。由于 APPV 基因组序列较长，且极易发生突变，不易获得 APPV 完整的全基因组序列[16]，而 E2基因突变率最高，在未来研究中可通过分析 E2基因以了解 APPV 毒株的遗传变异情况。通过对 APPV 毒株的流行区域进行分析，发现 Genotype 1分支中的毒株分布最为广泛，在全球均有分布和流行，而 Genotype 2和 Genotype 3仅在我国有过报道，表明 APPV 在我国的流行和变异情况较为复杂。本研究所鉴定到 GD-ZK 属于 Genotype 2，且 ORF 同源性分析结果显示 GD-ZK 与广东来源的 CNYJ 株同源性最高，其同源性为 99.7%，表明 GD-ZK 来源于广东本地的毒株。

E2蛋白是 APPV 的主要保护性抗原，具有多个中和表位(包括 B 细胞和 T 细胞结合位点)，可诱导机体产生 APPV 的中和抗体[6,26]。通过对 E2蛋白分子特征分析，结果发现 GD-ZK 与 Genotype 2的参考毒株在 E2 蛋白上发生了 S54T 和 S130T 2个氨基酸突变，这2个氨基酸位点的突变可作为 APPV 基因分型潜在的分子标记，而这些氨基酸位点突变对其抗原性的影响及是否与免疫选择压力有关仍需进一步研究。目前，APPV 尚无有效的治疗方法，ZHANG等[27]以杆状病毒为载体成功表达了 APPV E2基因的重组蛋白。将重组 E2蛋白免疫小鼠后可诱导小鼠产生较高水平的 APPV 中和抗体及淋巴细胞的增殖，可作为潜在的亚单位疫苗，这为后续疫苗的研发提供了新的思路。由于目前还未有 APPV 分离的报道，限制了对其致病机制及疫苗的深入研究，因此建立高效的 APPV 培养体系进行病毒的分离鉴定及相关致病机制和疫苗研究将会是今后研究的重点方向。