企鹅珍珠贝微卫星标记与生长性状的相关性研究

刘二田 陈 一 战 欣 顾志峰 王爱民,

(1.海南大学海洋学院, 海口 570228; 2.海南大学南海海洋资源利用国家重点实验室, 海口 570228)

企鹅珍珠贝(Pteria penguin), 属软体动物门(Mollusca), 双壳纲(Bivalvia), 翼形亚纲(Pteriomorphia)珍珠贝科(Pteriidae), 珍珠贝属(Pteria)。因其体型大、环境适应能力强、外套膜分泌珍珠质机能旺盛, 壳内所产附壳珠商品价值高, 珍珠层区厚大, 可做珍珠粉、珍珠化妆品、贝雕及工艺品的原材料,兼具药用功效等一系列优点, 是我国大型海水附壳珍珠的主产贝种, 也是热带亚热带地区重要海产经济贝类[1—3]。在我国主要分布于海南、广东大亚湾、广西涠洲岛和台湾西南等地, 尤其以海南沿海为主产地[4,5]。

我国于1968年成功实现企鹅珍珠贝的人工育苗[6], 但长期以来, 人工育苗的孵化率偏低, 无法实现产业化, 天然海区的采补和自然附苗仍是企鹅珍珠贝养殖种苗的主要来源[7]。贝类苗种繁育过程中通常采用数量较少的繁殖亲本, 连续人工繁育群体中近亲配子结合的概率增加, 从而导致由近交引起的适合度降低[8]。育种过程中常利用近交培育纯系, 但近交易导致繁殖力和生理机能相关性状的表型值降低[9]。李思发等[10]和刘宇飞等[11]通过分子标记技术分别对团头鲂(Megalobrama amblycephala)近交群体的遗传结构和剑尾鱼(Xiphophorus helleri)近亲交配家系的遗传多样性进行了研究, 结果表明近交能降低水产动物养殖群体基因频率变化、稀有基因缺失以及遗传多样性指标降低。傅强[12]对虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)自交家系的研究表明近交还可导致基因表达量的变化。目前, 我国养殖的贝类几乎全是野生型, 如果某种贝类发生了遗传衰退, 其在DNA水平上将表现出遗传多样性降低, 并在生长和抗性等方面表现为低值化[8]。遗传衰退对贝类优良种类的培育以及高品质贝类的养殖是十分不利的。

微卫星是一种基于PCR的分子标记技术, 可靠性高, 被广泛地应用于物种进化、遗传结构、亲子鉴定、种质资源评估及遗传图谱的构建等各个领域的研究中, 成为应用较广的分子标记之一[13]。在水产养殖动物中, 已在孔雀鱼(Poecilia reticulata)[14]、草鱼(Ctenopharyngodon idella)[15,16]、西施舌(Coelomactra antiquata)[17]、魁蚶(Scapharca broughtonii)[17]和凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)[18,19]等物种中, 采用微卫星标记开展了群体遗传多样性、遗传图谱构建及亲缘关系的研究。在双壳纲贝类中, 虾夷扇贝(Miiuhopecten yessoensis)[20]、栉孔扇贝(Chlamys farreri)[21]、马氏珠母贝(Pinctadamartensii)[22,23]和企鹅珍珠贝(P.penguin)[24]等均已有成功开发利用的微卫星标记。

许多学者通过对物种的表型性状数据与微卫星标记进行关联分析, 从而确定物种性状位点的功能和在染色体上的具体位置。如张群英等[25]利用15对EST-SSR标记对中华鳖(Pelodiscus sinensis)体长、体重、背甲长和裙边宽4个生长性状进行相关性分析, 发现5个位点与体长、体重、背甲长, 裙边宽显著相关; 安泉泉等[26]分析了106个微卫星标记与62尾牙鲆的体质量、体高和体长性状的相关性,获得了17个与这3个性状相关的标记。陈琼[27]利用6个微卫星标记对马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)表型性状的相关性进行分析, 得到与马氏珠母贝壳髙、壳长、壳宽、总重、左壳重、右壳重及珠层厚度7个性状具有相关性的微卫星位点。本研究旨在利用5个企鹅珍珠贝高度多态性的微卫星位点, 进行微卫星标记与生长性状的关联分析, 为企鹅珍珠贝分子遗传标记辅助选择育种提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 样本采集和生长性状数据测量

实验所用企鹅珍珠贝为广西北海海区养殖的1龄群体, 随机挑选无明显损伤、表观无病变、活力好的个体500个, 取外套膜置于1.5 mL离心管中,用75%酒精固定, 并于24h后更换1次酒精, 后存储在–20℃冰箱保存备用。利用游标卡尺测量企鹅珍珠贝形态性状(图1), 包括壳长(mm)、壳高(mm)和壳宽(mm), 精确度为±0.02 mm; 擦干表面水分用天平称量总重(Y, g), 精确度为±0.01 g。形态性状和体质量数据采集方法参照林先鑫等[28]和魏海军等[29]。

图1 企鹅珍珠贝形态性状图解Fig.1 Morphological characters of Pteria penguin

1.2 DNA提取

采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取企鹅珍珠贝基因组DNA(天根生化科技有限公司,北京), 具体方法如下: 向剪碎的企鹅珍珠贝外套膜组织中加入200 μL GA缓冲液和20 μL 蛋白酶K(20 mg/mL), 56℃消化2—3h后, 加入200 μL缓冲液GB,70℃放置10min至溶液变清亮; 加入200 μL无水乙醇, 将所得溶液转移至放入收集管中的吸附柱CB3中, 12000 r/min离心30s, 弃废液, 将吸附柱CB3放回收集管中。依次向CB3中添加500 μL缓冲液GD、600 μL漂洗液PW(2次), 反复漂洗后晾干吸附柱, 最后加入50 μL洗脱缓冲液TE, 提取的DNA产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测, 检测合格的基因组DNA用于后续引物筛选和PCR扩增。

1.3 基因型分型

本试验利用实验室前期筛选出的5个具有多态性的微卫星标记进行500个企鹅珍珠贝的PCR扩增。其中3个微卫星标记来自于许友卿[24], 2个来自本实验室企鹅珍珠贝转录组测序结果, 这5对微卫星引物序列信息如表1所示。

表1 5对微卫星引物序列信息Tab.1 Parameters of the five microsatellite primers

在微卫星标记的正向引物5′端加FAM标记, 荧光标记引物由上海生工生物工程有限公司合成。将基因组DNA用作模板, 进行PCR扩增。PCR反应体系为20 μL, 包含50 ng基因组DNA、10 μL 2×TaqPCR Mix(天根生化科技有限公司, 北京)、0.6 μL正向荧光引物(10 μmol/L)和0.6 μL反向引物(10 μmol/L)、灭菌双蒸水补足至20 μL。PCR反应条件为:94℃预变性5min, 之后进入3个步骤的循环, 即94℃变性30s, 各引物按各自退火温度退火30s, 之后72℃延伸30s, 此循环共30次, 最后72℃延伸7min。PCR扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测合格后,送由上海生工进行毛细管电泳分型。

1.4 数据统计分析

釆用毛细管电泳法分离PCR产物, 电泳图谱使用Genotyper4.0(Applied Biosysterms)软件分析, 精确读出扩增片段的长度及基因型的分型, 参照Weir等[30]、Botstein等[31]和Yeh等[32]的方法, 用Pop-Gene1.32软件计算群体的观测等位基因(Observed number of alleles,Na)、有效等位基因(Effective number of alleles,Ne)、观测杂合度(Observed Heterozygosity,Ho)、期望杂合度(Expected Heterozygosity,He)、哈迪温伯格平衡值(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)、Shannon’s指数(Shannon's Information index,I); 利用遗传分析软件Cervus3.0.7计算多态信息含量(Polymorphic Information Content, PIC)。

采用单因素方差分析法对5个多态性微卫星标记和500个企鹅珍珠贝个体的生长性状(壳高、壳长、壳宽和总重)进行相关性分析。与生长性状相关的微卫星标记不同基因型间再进行多重比较, 找到与企鹅珍珠贝生长性状相关的基因型。统计分析结果若P＜0.05, 则认为存在显著差异。各微卫星标记不同基因型个体各生长性状的平均值和标准差采用SPSS20.0软件计算。

2 结果

2.1 遗传多样性分析

5个微卫星位点在企鹅珍珠贝群体中所检测出的遗传多样性参数信息结果显示(表2), 5个微卫星位点在500个企鹅珍珠贝中共检测到48个等位基因,各个位点等位基因数和有效等位基因数分别为8—12和3.87—6.70, QEB-C54的等位基因数(n=12)最多, QEB-C65和UN-4652的等位基因数(n=8)最少。QEB-D15有效等位基因数和CL-232标记的有效等位基因数分别是最多和最少的。各位点的观测杂合度为0.4286—0.5570, 其中CL-232的观测杂合度最高, 位点UN-4652的观测杂合度最低; 期望杂合度为0.7421—0.8512, 期望杂合度最高为QEB-D15, 最低为CL-232; 平均观测杂合度为0.4907, 平均期望杂合度为0.7808, 显示5个位点均具有较高的杂合性; 各位点多态信息含量均大于0.7000(0.7260—0.8520), 具有高度多态性。这5对微卫星引物均显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P＜0.01)。

表2 五个SSR标记在企鹅珍珠贝中的遗传多样性参数Tab.2 Genetic diversity parameters of 5 SSR loci in the Pteria penguin population

2.2 微卫星标记和生长性状的相关性分析

在5个微卫星位点中, 微卫星位点QEB-D15和CL-232与壳宽均呈极显著相关(P＜0.01; 表3)。将这两个位点不同基因型间进行多重比较后发现, 在QEB-D15位点中, 基因型是239/263的个体壳宽为最大值, 基因型是239/273的个体壳宽为最小值, 两者之间存在显著差异(P＜0.05)。基因型是251/275的个体总重为最大值, 基因型为239/273的个体总重为最小值, 两者之间差异显著(P＜0.05; 表4)。在CL-232位点中, 基因型为157/174的个体壳宽为最大值, 基因型为177/192的个体壳宽为最小值, 两者之间差异显著(P＜0.05)。基因型为157/174的个体总重为最大值, 基因型为177/192的个体总重为最小值, 两者之间差异显著(P＜0.05)。同时发现基因型为157/174的个体壳长、壳宽和总重的均值都是最大的, 推测为优势基因型, 与表型性状存在正相关关系。基因型为177/192的个体壳长、壳宽、壳高和总重的均值都最小, 推测为劣势基因型(表5)。

表3 微卫星位点与企鹅珍珠贝生长性状相关性分析Tab.3 Correlation analysis between microsatellite loci and phenotypic traits of Pteria penguin

表4 微卫星位点QEB-D15不同基因型表型性状的平均值及多重比较Tab.4 Means and multiple comparisons of different genotypic phenotypic traits of QEB-D15

表5 微卫星位点CL-232不同基因型表型性状的平均值及多重比较Tab.5 Means and multiple comparisons of different genotypic phenotypic traits of CL-232

3 讨论

微卫星标记因具有高度多态性、易检测、引物通用性强、重复性好和信息含量大等优点而应用广泛[13]。本研究利用5个多态性微卫星标记对企鹅珍珠贝500个个体进行分型检测, Bostein等[31]对PIC的度量做出了具体限定, 本研究5个位点多态信息含量在0.726—0.852, 均为高度多态性位点。这5个微卫星标记共检测到48个等位基因, 其中等位基因数目最多的有12个(位点QEB-C54), 基本符合SSR位点对等位基因数和有效等位基因数的要求。

5个SSR标记中, 平均每个SSR位点有9.6个等位基因, 平均观测杂合度为0.4907, 平均期望杂合度为0.7808, 所有位点的观测杂合度均小于期望杂合度。这种种质退化现象在经过多代人工繁育和近亲繁殖的贝类群体中普遍存在, 李琪等[33]对皱纹盘鲍(Pacific abalone)和叶莹莹等[34]对厚壳贻贝(Mytilus coruscus)的研究也证实了上述现象。微卫星标记虽然是一种优点众多的分子标记手段, 但其有一个明显缺点是: 存在无效等位基因, 使扩增结果出现纯合子过剩, 从而导致了观测杂合度比实际情况低的现象[35]。本研究检测的企鹅珍珠贝为养殖群体, 存在一定程度的近交问题, 加之微卫星标记无法检测无效等位基因的问题, 最终导致观测杂合度小于期望杂合度。

微卫星标记在水产动物的标记-性状相关性分析中应用广泛。陈琼[27]对马氏珠母贝的研究, 将6个SSR位点与7个表型性状进行关联分析发现, 与贝壳珍珠质层厚度具有相关性的有4个位点, 其中两个位点(PM6和4PM50)表现正相关, 两个位点(2PM206和3PM10)表现负相关; 张曼等[36]从19个虾夷扇贝SSR位点中找到4个与生长性状具有相关性的SSR标记。在本研究中, 利用5个微卫星标记对企鹅珍珠贝表型性状(包括壳长、壳宽、壳高和总重)进行相关性分析发现, QEB-D15和CL-232两个位点与企鹅珍珠贝的壳宽均呈极显著相关(P＜0.01),出现了壳宽与两个SSR位点同时相关的现象, 这说明壳宽这个表型性状可能并非由单个基因控制, 这种单一性状与多个标记位点存在相关性的现象在其他研究中也出现过, 推测可能存在基因连锁或多因一效现象[37—40]。

位点QEB-D15基因型为239/263的个体壳宽为最大值, 基因型为239/273的个体壳宽为最小值,263 bp等位基因可能与壳宽之间存在正相关关系,而273 bp等位基因可能与壳宽之间存在负相关关系;位点CL-232基因型为157/174的个体壳长、壳宽、总重的均值较同一位点的其他基因型均为最大值,该基因型推测为优势基因型, 在育种实践中, 可以作为优先选择的基因型; 而基因型为177/192的个体壳长、壳宽、壳高和总重的均值较同一位点的其他基因型均为最小值, 推测该基因型为劣势基因型。筛选出的微卫星标记可以为企鹅珍珠贝分子标记辅助选择育种提供理论依据和参考。