活血生肌方外用对大鼠压力性损伤组织金属蛋白酶-9及其抑制因子-1 表达的影响

苏玉娟 潘孙峰 熊 烈 胡衍泽 单云岗 于恩光

压力性损伤，俗称压疮，是由于皮下组织受长时间的压力作用导致组织缺血缺氧的结果，若创面累及深部皮下组织、肌肉及骨骼，可导致严重感染甚至死亡[1]。压疮是常见的难愈性溃疡之一，属中医“疮疡”范畴，历代医家多主张“祛腐”“活血”“生肌”等法来进行治疗。本研究旨在通过检测压力性损伤组织中金属蛋白酶-9（MMP-9）及组织抑制因子-1（TIMP-1）表达水平及Ⅰ型胶原表达量的变化，了解MMP-9 及TIMP-1 与压力性损伤创面病理变化的关系，进而探讨活血生肌方对压力性损伤的治疗机制。

1 实验材料

1.1 动 物 60 只SPF 级成年雄性SD 大鼠，体质量180～200 g，购买于浙江维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（浙）2019-0001，委托饲养于本院附属某医学院动物实验中心。通风环境，室温（25±2）℃，湿度（55±5）%。实验人员均持有动物实验许可证，动物福利完全按照国际相关实验动物法规实施。本研究通过浙江省嘉兴市中医医院伦理委员会审核，伦理批件号：2019KY0454。

1.2 药 物 黄凡士林（性状：膏剂，规格：500 g/罐，由南昌白云药企有限公司生产，生产批号20211002）。活血生肌方（由当归、丹参、红花、黄芪、乳香、没药、白芨、白芷、重楼、甘草组成）（配置比例为2∶2∶1∶1.5∶1∶1∶1∶1∶1∶1），粉碎过40 目。药粉与黄凡士林1∶3 配比，加热混合制成膏剂，均匀涂抹于纱条上制成膏剂厚度为2 mm 活血生肌纱条，同时制作厚度为2 mm 凡士林纱条。以上均由浙江省嘉兴市中医医院药剂科提供并制备。

1.3 试剂与仪器 MMP-9、TIMP-1 二抗DAB 免疫组化试剂盒（批号PV8000D，北京中杉有限公司），一抗ABD-0030 稀释液（批号211216S963c，福州迈新生物科技开发有限公司）。荧光正置显微镜（Zeiss，Axio Scope A1），凝胶成像仪（Tanon 5200 Multi）、蛋白质电泳系统（Bio.Rad），组织均质器（宁波新芝，Scientz-48）。

2 实验方法

2.1 造 模 大鼠实验前适应性喂养1 周，应用缺血-再灌注磁片循环压迫的方式，在大鼠背部建立上下两个压疮模型，通过皮层切口分离肌层，将无菌铁片植入皮下。大鼠如无感染现象，进行磁铁施压。施压24 h 后，使用无菌刀片划破受压皮肤至真皮层，继续施压24 h。见图1。

图1 大鼠背部建立压疮模型示意图

2.2 分组与给药 将造模成功的60 只压疮模型大鼠背部创面编号，按随机数表法分为治疗组和对照组，每组30 只，治疗组大鼠创面常规处理，予活血生肌纱条外敷后用无菌纱布覆盖，1 次/d，直至实验结束。对照组大鼠创面常规处理，予凡士林纱条外敷后用灭菌纱布覆盖，1 次/d，直至实验结束。

2.3 观察指标

2.3.1 压疮组织MMP-9 及其TIMP-1 表达 分别在换药第1、3、5、7、9 天各组随机抽取6 只压疮模型大鼠（12 个创面）用腹腔注射100 g/L 水合氯醛（300 mg/kg）的方法麻醉后切取背部创面中心部位处大小为0.3 cm×0.3 cm 的全层皮肤组织。取材后，予大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g 处死。根据所购试剂盒步骤，采用免疫组化法及Image J 图像软件分析测定创面组织中MMP-9 及其TIMP-1 蛋白表达量。

2.3.2 压疮组织Ⅰ型胶原蛋白及胶原纤维表达 取各组大鼠创面组织切片，常规脱蜡脱水，Masson 染色，组织胶原纤维呈蓝色。显微镜下观察胶原纤维表达情况。采用Image J 图像分析软件分析每平方毫米组织中的Ⅰ型胶原及胶原纤维表达量。

2.4 统计学方法 应用SPSS 17.0 统计软件，正态分布计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析；非正态分布计量资料以中位数（P25-P75）表示，组间比较采用Wilcoxon 秩和检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 两组大鼠疮面组织MMP-9 表达量比较 换药第1 天，两组大鼠创面组织MMP-9 表达差异无统计学意义（P＞0.05）；换药第3 天开始，治疗组大鼠创面组织MMP-9 表达量较对照组降低（P 均＜0.01），见表1、图2。

图2 免疫组化法检测不同方法处理大鼠背部压力性损伤组织MMP-9（棕黄色）表达（二氨基联苯胺-苏木素染色，×100）注：a、b、c、d 分别为凡士林纱布换药第3、5、7、9 天创面组织MMP-9 镜下表达情况；A、B、C、D 分别为活血生肌方纱条换药第3、5、7、9 天创面组织MMP-9 镜下表达情况；MMP-9 为金属蛋白酶-9

表1 两组大鼠创面组织各时间点MMP-9 表达量比较（）

表1 两组大鼠创面组织各时间点MMP-9 表达量比较（）

注：治疗组常规创面处理基础上给予活血生肌纱条换药；对照组常规创面处理基础上给予凡士林纱条外敷；MMP-9 为金属蛋白酶-9；与对照组比较，aP＜0.01

3.2 两组大鼠疮面组织TIMP-1 表达量比较 换药第1 天，两组大鼠创面组织TIMP-1 表达差异无统计学意义（P＞0.05）；换药第3 天开始，治疗组大鼠创面组织TIMP-1 含量较对照组升高明显（P 均＜0.05），见表2、图3。

图3 免疫组化法检测不同方法处理大鼠背部压力性损伤组织TIMP-1（棕黄色）表达（二氨基联苯胺-苏木素染色，×100）注：a、b、c、d 分别为凡士林纱布换药第3、5、7、9 天创面组织TIMP-1 镜下表达情况；A、B、C、D 分别为活血生肌方纱条换药第3、5、7、9 天创面组织TIMP-1 镜下表达情况；TIMP-1 为组织抑制因子-1

表2 两组大鼠创面各时间点TIMP-1 含量比较（）

表2 两组大鼠创面各时间点TIMP-1 含量比较（）

注：治疗组常规创面处理基础上给予活血生肌纱条换药；对照组常规创面处理基础上给予凡士林纱条外敷；TIMP-1 为组织抑制因子-1；与对照组比较，aP＜0.05

3.3 两组大鼠疮面组织Ⅰ型胶原蛋白表达量比较换药第1 天，两组大鼠创面组织Ⅰ型胶原蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；换药第3 天，两组大鼠创面组织均可见Ⅰ型胶原蛋白的形成，治疗组高于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；换药第5、7、9 天，治疗组Ⅰ型胶原蛋白表达较对照组明显增多（P 均＜0.05），胶原蛋白结构致密，成熟度较高。见表3、图4。

表3 两组大鼠创面组织各时间点Ⅰ型胶原蛋白表达量比较（）

注：治疗组常规创面处理基础上给予活血生肌纱条换药；对照组常规创面处理基础上给予凡士林纱条外敷；与对照组比较，aP＜0.05

图4 不同方法处理大鼠背部压力性损伤组织中Ⅰ型胶原（蓝色）表达（Masson 染色，×100）

3.4 两组大鼠疮面组织胶原纤维表达量比较 两组大鼠在换药前压疮皮肤组织胶原纤维排列紊乱，表达量少，差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组比较，治疗组胶原纤维表达量从第3 天开始增多，但差异无统计学意义（P＞0.05）；第5、7、9 天，治疗组胶原纤维表达量较对照组明显增多（P 均＜0.05），含量丰富，排列有序。见表4、图5。

图5 不同方法处理大鼠背部压力性损伤组织中胶原纤维（蓝色）表达（Masson 染色，×100）

表4 两组大鼠创面组织各时间点胶原纤维表达量比较（）

表4 两组大鼠创面组织各时间点胶原纤维表达量比较（）

注：治疗组常规创面处理基础上给予活血生肌纱条换药；对照组常规创面处理基础上给予凡士林纱条外敷；与对照组比较，aP＜0.05

4 讨论

在压疮愈合进程中，以胶原纤维为主要成分的细胞外基质（ECM）的过度降解是创面难愈的重要因素。而MMP-9 是参与ECM 降解的蛋白酶，其过度表达可影响胶原沉积过程，导致组织液化，其活性受金属蛋白酶抑制剂（TIMP-1）的影响。研究表明，MMP-9 参与压疮[2-3]病理过程，其在创面组织表达增高是溃疡愈合不良的预测因素；慢性创面TIMP-1 缺如或显著低于正常愈合伤口，且MMP/TIMP 比例的失衡可能与伤口愈合延迟有关[4]。以上均提示MMP-9 不利于创面愈合，而TIMP-1 上调可能中和过强MMP-9的活性，因此MMP-9、TIMP-1 的表达失调与创面不愈合密切相关。

压疮为临床典型的慢性皮肤溃疡。课题组根据压疮的病因病机，采用活血生肌方治疗12 年，应用活血生肌中药灌洗联合封闭式负压引流治疗压疮等难治性创面[5-6]，疗效显著。其中黄芪具有益气升阳、托毒生肌之效，方中重用为君药；当归、丹参化瘀通络，白芷辛温通窍、溃脓止痛，白及活血生肌，共为臣药；辅以红花、乳香、没药为佐药，增活血化瘀之功；甘草调和诸药，滋润肌肤，诸药合用，共奏活血行气、化瘀生肌之效。研究表明，活血生肌方的方药组份黄芪、当归、丹参等具有调节MMP-9、TIMP-1 表达，促进血管新生作用[7-8]。本实验结果显示，治疗组在使用活血生肌方外用3 d 后，压疮组织中MMP-9 含量明显降低，同时TIMP-1 的含量提高；使用活血生肌方外用5 d 后，胶原蛋白及胶原纤维的表达也均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。

综上所述，活血生肌方对压力性损伤的良性影响，可能是通过调节创面MMP-9 及TIMP-1 表达水平，以减少胶原蛋白的降解，进而促进压疮组织的愈合。但肉芽组织由细胞及细胞外基质组成，此实验只表明其能阻止ECM 过度降解，但活血生肌方能否促进组织中细胞生长还有待于进一步深入研究。