改良完整卵巢冷冻移植对去势大鼠内分泌功能的影响

2023-01-30 13:21华克勤
上海医学 2022年12期
关键词:去势内分泌卵泡

丁 岩 张 英 华克勤

随着肿瘤诊疗技术的不断发展,越来越多的癌症患者得以长期存活。肿瘤治疗中,大剂量的化学治疗和(或)放射治疗常常会影响女性的卵巢功能,引起卵巢功能衰竭,导致不育等问题出现,严重影响患者的身心健康和社会角色。因此,在积极治疗肿瘤的同时,如何有效保存卵巢的生殖生育功能,提高女性肿瘤患者的生殖健康水平,已成为临床关注热点。常用的生育力保存方法有胚胎冷冻、卵母细胞冷冻和卵巢组织冷冻。卵巢组织冷冻移植适用于各个年龄段患者,具有易取材、不延误肿瘤治疗等优点,因而成为保留癌症患者生育力的理想方式。目前,全球已有超过3 000例患者进行卵巢组织冷冻,超过130例患者经自体移植后成功分娩健康婴儿[1-3]。卵巢组织冷冻移植后必须重建血管才能恢复血供,在血管再生之前有持续3~7 d的缺血期,在新血管形成期间也会发生局部缺血再灌注损伤,这些均可导致移植卵巢组织中始基卵泡的丢失,从而影响其移植后的存活时间[4-5]。研究[6]报道,移植卵巢组织大多在移植后4~5年会再次发生卵巢功能衰竭。移植完整卵巢在理论上能快速恢复血供,缩短缺血时间,减少缺血性损伤发生。与卵巢组织相比,完整卵巢包含更多的卵泡池,且能提供卵泡和卵母细胞发育的正常环境,可延长卵巢功能维持的时间;另外,完整卵巢移植无需预先予药物刺激,可以原位移植,提供自然妊娠机会。因此,完整卵巢冷冻移植被认为是一种值得期待的保留和恢复卵巢功能的方法[7-8]。

目前,完整卵巢冷冻移植已经在小鼠、大鼠、兔、羊等动物实验中取得较好效果,陆续有动物恢复内分泌功能并成功分娩的报道。但完整卵巢冷冻仍处于研究初始阶段,迄今还没有灵长类动物甚至人类冷冻移植的报道,动物完整卵巢冷冻后卵泡存活率存在较大差异,恢复率为28%~100%,活产率较低,为11%~29%[7, 9-10]。完整卵巢冷冻移植的主要技术难点在于充分分布冷冻保护剂(cryopretective agent,CPA),减少CPA引起的毒性损伤,以及血管内形成冰晶。根据深低温生物学理论,CPA在导入细胞内的同时,细胞内的水分向细胞外渗出,进入细胞内的CPA理想浓度应呈线性递增,并能在达到最终浓度后保持平衡。因此,本研究根据理想曲线设计新的灌注装置,对传统灌注方式进行改良,将冷冻复苏的完整卵巢异体原位移植至去势大鼠,探讨完整卵巢冷冻移植对大鼠内分泌功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 30只健康、雌性清洁级Lewis大鼠(8~10周龄,体重180~200 g)购自上海西普尔必凯实验动物有限公司,由复旦大学药学院药效评价动物实验中心在标准条件下饲养。动物入室后适应1周,连续5~7 d行阴道涂片判断动情周期,选取有规律动情周期的大鼠作为实验对象。随机选取10只大鼠作为完整卵巢供体。选取20只大鼠随机分为正常对照组和去势移植组,每组10只。正常对照组大鼠行开关腹假手术操作;去势移植组大鼠在双侧卵巢切除术后1周,通过血管吻合将冷冻复苏的完整卵巢进行异体原位移植。本实验经复旦大学药学院实验动物伦理委员会批准(批号20150021)。

1.2 实验方法

1.2.1 完整卵巢的获取 以1%戊巴比妥钠溶液(40 mg/kg)行腹腔内注射麻醉,仰卧位固定大鼠。沿腹部正中线自剑突至耻骨联合逐层剪开并暴露腹腔。在手术显微镜8倍视野下操作,参照Wang等[11]的方法获取大鼠带蒂完整卵巢。完全游离下腔静脉与腹主动脉,分别结扎左肾动静脉和椎动静脉。沿右侧卵巢动静脉走向自上而下分离腹膜,游离并结扎卵巢上方韧带及血管。游离右侧子宫角上段,缝扎子宫角下方动静脉。于腰血管水平在腹主动脉置入软硅胶灌洗管,缓慢低压匀速注入4 ℃肝素化生理盐水,灌洗至下腔静脉流出液体转为清亮,至右侧卵巢及子宫角上段呈苍白色为止。离断获取完整卵巢,包括右侧卵巢、输卵管及子宫上段,以及连接卵巢动静脉的腹主动脉和下腔静脉。

1.2.2 完整卵巢改良灌注与冷冻复苏 根据深低温生物学理论,本研究设计了可使不同CPA浓度连续导入的精准恒流灌注装置,此装置主要由2个精密脉冲控制输液泵和3个容器组成,通过精密脉冲控制输液泵精准调节流速,预先混合CPA后动态调控灌注完整卵巢的CPA浓度。整个灌注过程于碎冰上进行,CPA均经4 ℃预冷。见图1。CPA配置方法如下。①0 mol/L CPA:M2培养液+ 10%热灭活胎牛血清(fetal calf serum, FCS)。②1.5 mol/L CPA:M2培养液+10%FCS+1.5 mol/L二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)+ 0.1 mol/L海藻糖。③3.0 mol/L CPA:M2培养液+10%FCS+3.0 mol/L DMSO+0.2 mol/L海藻糖。

图1 CPA连续导入的精准恒流灌注装置

根据CPA浓度理想曲线及灌注装置设计,按照“浓度-时间-流量”物理模型计算数据,将带蒂的完整卵巢转移至自制装置,容器1中为3.0 mol/L CPA 2.187 5 mL,容器2中为0 mol/L CPA 4.812 5 mL,容器3中为1.5 mol/L CPA 5.000 0 mL浸泡完整卵巢,精密脉冲控制输液泵1流速为0.15 mL/min,精密脉冲控制输液泵2流速为0.35 mL/min,使前15 min内灌流入完整卵巢的CPA浓度从0 mol/L至1.5 mol/L呈线性递增,最后以1.5 mol/L浓度平衡5 min。见图2。

图2 完整卵巢灌注的浓度-时间-流量曲线

灌注结束后,将完整卵巢及1.5 mol/L CPA 15 mL转移至50 mL离心管中,置入程序化冷冻仪中进行冷冻。冷冻流程:①起始温度为0 ℃,以2.0 ℃/min速度降至-7 ℃;②-7 ℃保持10 min以便进行手工植冰;③以0.3 ℃/min速度降至-40 ℃;④以10.0 ℃/min速度降至-120 ℃。冷冻结束后将离心管迅速置入液氮罐中,保存1周。

复苏时将离心管从液氮罐中取出,于室温中以120 r/min,离心半径25 cm,旋转30 s后,浸入40 ℃水浴中,直至组织完全融解,时间约5 min。按原速率在自制恒流灌注装置上逆向灌注解融液,使灌注进入完整卵巢的CPA浓度从1.5 mol/L至0 mol/L呈线性递减15 min,以0 mol/L浓度平衡5 min。去除灌洗管,结扎腹主动脉下端,修剪后备用。

1.2.3 大鼠卵巢去势模型建立 去势移植组大鼠行腹腔内注射麻醉后,仰卧位固定,沿下腹部正中线剪开皮肤约3 cm,逐层剪开并暴露腹腔,找到V字型子宫,沿子宫找到卵巢,结扎并切除双侧卵巢和上1/3子宫,缝合腹腔。正常对照组大鼠行开关腹手术,不切除卵巢。

1.2.4 完整卵巢异体原位移植 去势模型建立后的第7天,行完整卵巢异体原位移植。参照Wang等[11]和Ding等[12]的大鼠完整卵巢冷冻移植方法,将去势移植组大鼠麻醉后固定,打开腹腔。在手术显微镜10倍视野下操作,使用心耳钳阻断左肾静脉下方的腹主动脉和下腔静脉长约1.5 cm。将修整后的完整卵巢置于腹主动脉右侧,采用10-0缝线分别行腹主动脉-腹主动脉端侧吻合和下腔静脉-下腔静脉端侧吻合。松开心耳钳开放血流,可见吻合口饱满无狭窄,腹主动脉残端有搏动,下腔静脉残端充盈,卵巢、子宫上段颜色迅速由苍白转为红润。如吻合口有渗血,可用干棉签轻轻压迫吻合口数分钟,大多可止血。寻找右侧子宫断端,切除部分残端瘢痕组织,采用7-0缝线间断缝合行子宫-子宫端端吻合。术后向腹腔内注入38 ℃林格注射液1~3 mL,注入头孢噻肟钠10 mg。将大鼠置于恒温平台上保温,待其苏醒后放入鼠笼正常饲养。

1.3 观测指标

1.3.1 一般情况 去势模型建立后,每日早上9:00测量大鼠体重,观察其生命体征、进食、排便和行为变化等。

1.3.2 动情周期检测 大鼠的动情周期为4~5 d,包括动情前期、动情期、动情后期和动情间期。卵巢去势模型建立后每日早上9:00取无菌棉签蘸取少量0.9%氯化钠溶液,轻轻于大鼠阴道深处顺时针旋转数周,取出后同方向涂抹于载玻片上,室温中干燥后,以95%乙醇固定,H-E染色后置于光学显微镜(简称光镜)下观察。

1.3.3 激素水平检测 于移植前、移植后2周、移植后4周分别取大鼠眼眶血,血样本静置15 min,3 000 r/min,离心半径10 cm,离心20 min后,取血清。采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测血清卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、雌二醇、抗米勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)水平。

1.3.4 卵巢组织形态学检测 于移植后4周处死大鼠,留取卵巢组织置于10%多聚甲醛溶液中固定,石蜡包埋,常规切片,H-E染色后于光镜下观察,计数各级卵泡。

2 结 果

2.1 大鼠的一般情况 去势移植组大鼠卵巢去势模型建立后均存活,一般情况好,进食和排便均正常,活动自如,体重增长量与正常对照组大鼠的差异无统计学意义[(1.55±0.62)g/d比(1.57±0.74)g/d,P>0.05]。移植后大鼠均存活,且在移植后3 d内均出现蜷缩状、活动减少、进食减少、排便减少等表现,去势移植组大鼠体重显著低于正常对照组[(197.1±0.8)g比(201.4±0.6)g,P<0.05];移植第4天后,去势移植组大鼠活动逐渐增多,进食增多,体重增长量显著高于正常对照组[(1.56±0.44)g/d 比(1.51±0.52)g/d,P>0.05]。见图3。

图3 两组大鼠建模后的体重变化趋势

2.2 大鼠动情周期的变化 去势模型建立后,去势移植组大鼠动情周期消失,阴道涂片显示其持续为动情间期,在移植后(11±2)d出现动情期,恢复正常动情周期;正常对照组大鼠行假手术操作后,大鼠动情周期均正常。

2.3 大鼠血激素水平的变化 移植前,去势移植组大鼠的FSH水平显著高于正常对照组,而LH、雌二醇、AMH水平显著低于正常对照组(P值均<0.01)。移植后2周,去势移植组大鼠的FSH水平较移植前显著降低(P<0.05),但显著高于正常对照组(P<0.05);LH、AMH水平均较移植前显著升高(P值均<0.05),但显著低于正常对照组(P值均<0.05);雌二醇水平较移植前显著升高(P<0.05),与正常对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。移植后4周,去势移植组大鼠FSH水平较移植前显著降低(P<0.05),雌二醇、LH、AMH水平较移植前均明显升高(P值均<0.05),FSH、LH、雌二醇水平与正常对照组的差异无统计学意义(P值均>0.05),但AMH水平仍显著低于正常对照组(P<0.05)。见表1。

表1 两组大鼠移植前后血激素水平的比较

2.4 大鼠卵巢组织形态学的变化 去势移植组大鼠移植后4周,解剖可见移植侧卵巢颜色红润,表面点状突起,子宫瘢痕可见,其中4只大鼠移植卵巢子宫可见不同程度的粘连包裹。见图4A。光镜下可见移植卵巢皮质内各级卵泡和黄体,髓质内血管形态正常。见图4B。去势移植组卵巢质量为(21.81±3.34)mg,正常对照组卵巢质量为(25.23±1.13)mg,两组间的差异无统计学意义(P>0.05)。计数移植卵巢形态正常的各级卵泡,去势移植组大鼠的卵巢始基卵泡、初级卵泡和总卵泡数均显著少于正常对照组(P值均<0.05);次级卵泡、窦卵泡数量与正常对照组的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表2。

A 箭头所示为移植侧卵巢,对侧卵巢缺如 B 移植的卵巢组织(H-E染色,×200)

表2 去势移植大鼠卵巢中形态正常的各级卵泡数目

3 讨 论

血管吻合的完整卵巢冷冻移植为女性癌症患者保留长期内分泌和生育能力提供了一种值得期待的新方法,具有很好的应用前景。但完整卵巢作为冻存体,体积大,结构复杂,卵巢组织含有干细胞、卵巢细胞、间质、血管等不同的组织成分,且卵母细胞和颗粒细胞并非位于毛细血管周围,因此,完整卵巢的冷冻更加复杂和困难,目前尚无公认、标准的最佳完整卵巢冷冻方案。

采用冷冻灌注技术可使CPA充分分布到细胞以减少卵泡丢失和血管内冰晶形成,在冷冻前通过卵巢动脉插管一步或按浓度由低到高分步导入CPA,通过卵巢血管系统使CPA快速渗透弥散到卵巢内部各个部位[13-15]。但完整卵巢相对较大,CPA充分渗入卵巢各个部位需要一定的灌注时间和速度,灌注过程是冷缺血的过程,随着灌注时间的延长,延长了缺血时间,也增加了CPA的毒性损伤[16]。研究[17]发现,灌注本身会损害卵巢导致卵泡的丢失。另外,灌注还会引起卵巢髓质内微血管损伤,出现细胞外冰晶形成,从而产生严重的损害,影响完整卵巢的血运重建和卵泡存活率[18]。因此,需要进一步研究更适宜的完整卵巢灌注方案,从而在提高CPA分布的同时减少灌注对完整卵巢的损伤。

根据深低温生物学理论,CPA在导入细胞内的同时,细胞内的水分向细胞外渗出,理想状态为进入细胞内的CPA浓度呈线性递增,并能在达到最终浓度后保持平衡一段时间。曾有学者在复合组织皮瓣冷冻保存的研究[19-20]中采用连续导入法平衡组织内保护剂浓度,发现10只大鼠中有9只冷冻皮瓣组织可以存活至60 d,提示连续导入可以显著减轻CPA导入过程中对细胞造成的体积损伤和渗透损伤。因此,本研究根据深低温生物学理论对灌注方式进行改良,设计了可连续导入的精准恒流灌注装置,通过两个精密脉冲控制输液泵精准调节流速,使CPA预先混合,动态调控CPA浓度,从而使进入完整卵巢的CPA浓度从0 mol/L至1.5 mol/L呈线性递增15 min,最后在1.5 mol/L浓度平衡5 min;冷冻解融后再次灌注时,使浓度反向线性递减去除CPA。

本研究将完整卵巢灌注冷冻后行血管吻合的同基因异体原位移植,结果发现,去势移植组大鼠在移植3 d后一般情况恢复,移植(11±2)d出现动情周期;移植后2周,FSH、LH、雌二醇等激素水平已有恢复;移植后4周血激素水平在正常范围波动,移植卵巢大小和质量正常,卵巢结构正常,各级卵泡形态正常。上述结果均提示,去势移植组10只大鼠在完整卵巢冷冻移植后完全恢复了卵巢内分泌功能。既往完整卵巢冷冻移植的研究中,只有少数报道显示恢复内分泌功能,恢复率为28%~100%。Wang等[21]的研究结果显示,7只大鼠中有4只在完整卵巢冷冻移植3个月后恢复卵巢内分泌功能。Qi等[22]的研究结果显示,10只大鼠中有8只在完整卵巢冷冻移植术后恢复内分泌功能,雌激素水平在(14±3)d后升高。而本研究中,大鼠的内分泌恢复率高,恢复时间早。Onions等[14]将羊完整卵巢异位移植至其颈部,7个月后7只羊的卵巢血管仍然通畅,但仅有2只羊具有卵巢周期性改变,这提示血管开放通畅并不能说明卵巢功能恢复,冷冻引起的卵泡丢失可能是主要的影响因素。因此,本研究改进完整卵巢灌注方式可能更有利于保护卵泡,减少冷冻对卵泡的损伤,促进卵巢功能的恢复。Campbell等[23]的研究结果显示,在羊完整卵巢冷冻移植前后给予抗凝药物,14只羊于术后3周均恢复内分泌功能,这可能与减少移植后血栓形成有关。本研究移植前后虽然未予大鼠抗凝药物但恢复率高,可能与血管吻合方式有关,本研究因大鼠卵巢血管微细,血管吻合采用腹主动脉-腹主动脉、下腔静脉-下腔静脉端侧吻合方式,而上述文献中羊完整卵巢血管吻合采用卵巢动脉-卵巢动脉、卵巢静脉-卵巢静脉端端吻合,所以本研究中血管直径较大,血栓形成的发生风险可能较小。

AMH主要由卵巢窦前卵泡和小的窦卵泡生成,目前认为血清AMH水平与窦卵泡数量呈正相关,可以更真实地反映原始卵泡库存情况,用于评估卵巢储备功能[24]。本研究结果显示,去势移植组大鼠在完整卵巢冷冻移植后2周,AMH水平较移植前明显升高,但术后4周AMH仍未恢复到正常水平,并且移植后4周卵巢始基卵泡及初级卵泡均较对照组明显减少,提示完整卵巢冷冻移植后仍有卵泡丢失,影响卵巢储备功能。另外,由于去势移植组大鼠为一侧卵巢冷冻移植,正常对照组为双侧卵巢,卵巢储备功能可能本身也存在差异,后续可进一步改进实验方案,将对照组设为一侧卵巢进行对比,以更精确地观察完整卵巢冷冻移植对卵巢储备的影响。对于完整卵巢冷冻移植的长期内分泌功能,目前大鼠动物实验中未见长期随访。Arav等研究[25]结果显示,8只羊中有3只在完整卵巢冷冻移植后6个月恢复卵巢周期性;移植6年后2只羊卵巢大小形态正常,组织形态学检查见正常卵泡,而另外1只羊卵巢萎缩,卵泡衰竭。因此,改良完整卵巢冷冻移植对卵巢长期内分泌功能的影响尚需进一步研究。

目前,完整卵巢冷冻移植已经在羊等大型哺乳动物中进行,而本研究选择大鼠作为研究对象,主要原因为大鼠常见、价格低廉、容易获得、饲养容易、适应性强、性周期稳定等,并且既往对大鼠卵巢功能尤其是卵泡发育的研究广泛[26]。但大鼠卵巢血管微细,因此血管吻合完整的卵巢原位移植需要异体移植,存在移植免疫的发生风险。本研究为减少免疫排斥反应发生,选用Lewis同基因大鼠。另外,大鼠卵巢体积明显小于人卵巢,可能有利于完整卵巢冷冻与卵巢功能的恢复。在今后的研究中,可以选择羊甚至人完整卵巢以进一步探讨改良灌注对完整卵巢冷冻移植的功能,包括长期内分泌和生育功能的影响。

综上所述,本研究行可连续导入的完整卵巢灌注后,冷冻移植至卵巢去势大鼠,动情周期和激素水平在移植后4周恢复正常,提示改良完整卵巢冷冻移植可有效重建卵巢内分泌功能。

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