虫草素对D-半乳糖与三氯化铝联合诱导阿尔茨海默病小鼠认知功能的改善作用及机制探讨

彭达，赵爽，宋润蔚，公元，韩冷，宗闰喆，王浩，田华，2，张继国

1 山东第一医科大学药学院，山东泰安 271016；2 山东中医药大学药学院，山东济南 250355

阿尔茨海默病（AD）是一种以行为异常、渐进性认知功能障碍为主要临床表现的中枢神经系统退行性疾病［1］。随着社会人口老龄化加剧，AD发病率逐渐升高，严重威胁人类健康。但目前，临床还未有有效的AD治疗药物，主要应用的化学合成药物或多肽类化合物不仅价格昂贵，而且长期应用还具有明显的不良反应。因此，人们越来越多地将注意力转向天然化合物［2］。虫草素，又称3'-脱氧腺苷，是蛹虫草核苷酸的衍生物，也是天然中药材冬虫夏草的活性成分之一，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种药理活性［3］。近年研究发现，虫草素可减轻东莨菪碱所致小鼠记忆障碍，可改善海马CA1、CA3区脑缺血损伤，并可通过增强胆碱能神经系统功能、减少海马神经元损伤、抑制小胶质细胞炎症因子的产生，进而对神经退行性疾病产生一定的保护作用［4］。目前虽然已有研究发现虫草素对AD具有一定改善作用［5］，但对其确切的作用和机制仍未完全明了。本研究拟以D-半乳糖（D-gal）联合三氯化铝（AlCl3）诱导小鼠AD模型，通过Morris水迷宫检测小鼠认知功能，观察虫草素对AD的改善作用，并从抗炎、抗氧化角度对其作用机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 3月龄雄性C57BL/6J小鼠54只，体质量20~25 g，均为SPF级，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供［SCXK（鲁）20190003］。于SPF级实验室进行饲养，室温（22±1）℃，湿度45%~60%，光照周期为12 h/12 h（光照时间早8点至晚8点），自由饮食、水。实验方案经山东第一医科大学动物实验伦理委员会批准［SYXK（鲁）20190022］。

1.1.2 实验试剂和仪器 虫草素（CAS#73-03-0）购自上海源叶生物科技有限公司，盐酸多奈哌齐购自江苏豪森药业集团有限公司，D-gal购自北京索莱宝科技有限公司，AlCl3购自天津市大茂化学试剂厂，以上试剂均用生理盐水溶解配置成所需浓度；β-淀粉样蛋白（Aβ）1-40（Aβ1-40）、Aβ1-42与IL-6试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司；丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。仪器：Morris水 迷 宫（Top Scan，美 国）；Infinite F200型Tecan Infinite酶标仪（TECAN，瑞士）；UV1810S型紫外可见光分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）。

1.2 实验分组及给药 将C57BL/6J小鼠随机分为6组，分别为空白组、模型组、虫草素高剂量组、虫草素中剂量组、虫草素低剂量组、多奈哌齐组，每组9只。除空白组给予等剂量溶剂外，其余各组腹腔注射D-gal 120 mg/kg同时灌胃给予AlCl3200 mg/kg诱导AD模型，给药共9周。上述给药4周后，虫草素高、中、低剂量组分别灌胃40、20、10 mg/kg虫草素；多奈哌齐组灌胃0.9 mg/kg盐酸多奈哌齐；空白组和模型组灌胃等剂量溶剂，灌胃给药5周。D-gal联合AlCl3给药的第9周，开始Morris水迷宫实验（MWM），检测小鼠的学习记忆功能。行为学结束，取小鼠脑组织，分离皮质和海马，检测相应指标。

1.3 小鼠学习记忆能力检测 采用MWM实验［6］，包括定位航行实验和空间探索实验。定位航行实验连续5 d，记录小鼠的逃生潜伏期。60 s内小鼠寻找到平台，记录其实际找到平台的潜伏期；大于60 s未找到平台者，潜伏期以60 s计。第6天进行空间探索实验，撤去逃生平台，在平台所在象限的对侧象限放入小鼠，记录小鼠在1 min内穿越原平台所在区域的次数。用TOPSCAN软件记录并分析其行为学轨迹。

1.4 大脑皮质和海马Aβ1-40、Aβ1-42和IL-6水平检测 采用ELISA法。行为学结束后，处死各组小鼠，分离大脑皮质和海马，加入生理盐水分别制备皮质和海马组织匀浆，4 ℃、2 500 r/min离心10 min，取上清，使用ELISA检测试剂盒，按说明书步骤操作分别对大脑皮质和海马内Aβ1-40、Aβ1-42和IL-6水平进行测定，于酶标仪450 nm处测定光密度值。

1.5 大脑皮质氧化指标检测 取各组小鼠大脑皮质，按照说明书操作制备脑组织匀浆，离心、取上清，采用TBA法测定MDA水平，同时采用羟胺法、比色法和紫外法分别测定SOD、POD和CAT活力，具体步骤按照试剂盒说明书操作。

1.6 统计学方法 采用GraphPad Prism8.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 虫草素对D-gal联合AlCl3诱导AD小鼠学习记忆能力的影响 在定位航行实验中，随着实验天数的增加，各组小鼠的逃生潜伏期缩短；从第2天起，与空白组相比，模型组逃生潜伏期延长（P均＜0.05）；而与模型组相比，虫草素各剂量组和多奈哌齐组逃生潜伏期大都从第3天开始下降（P均＜0.05）；结果见表1。在空间探索实验中，空白组、模型组、虫草素高剂量组、虫草素中剂量组、虫草素低剂量组、多奈哌齐组平台穿越次数分别为（2.26±0.25）、（0.94±0.20）、（0.89±0.38）、（1.88±0.45）、（2.00±0.33）、（1.62±0.18）次/分；与空白组相比，模型组平台穿越次数减少（P＜0.05）；与模型组相比，虫草素中、高剂量组和多奈哌齐组平台穿越次数增加（P均＜0.05）。

表1 各组小鼠定位航行实验逃生潜伏期比较（s，±s）

表1 各组小鼠定位航行实验逃生潜伏期比较（s，±s）

注：与空白组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05。

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2.2 虫草素对D-gal联合AlCl3诱导AD小鼠脑组织中Aβ1-40和Aβ1-42水平的影响 与空白组相比，模型组大脑皮质与海马组织中Aβ1-40水平升高；与模型组相比，虫草素低、高剂量组与多奈哌齐组海马组织中Aβ1-40水平降低（P均＜0.05），虫草素中、高剂量组与多奈哌齐组大脑皮质中Aβ1-40水平降低（P均＜0.05）。与空白组相比，模型组大脑皮质与海马组织中Aβ1-42水平升高（P均＜0.05）；与模型组相比，虫草素中、高剂量组与多奈哌齐组大脑皮质及海马组织中Aβ1-42水平降低（P均＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠脑组织中Aβ1-40和Aβ1-42水平比较（pg/mg protein，±s）

表2 各组小鼠脑组织中Aβ1-40和Aβ1-42水平比较（pg/mg protein，±s）

注：与空白组相比，#P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

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2.3 虫草素对D-gal联合AlCl3诱导AD小鼠脑组织中IL-6水平的影响 与空白组相比，模型组大脑皮质和海马组织中IL-6水平升高（P均＜0.05）；与模型组相比，虫草素中、高剂量组与多奈哌齐组大脑皮质和海马组织中IL-6水平降低（P均＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠脑组织中IL-6水平比较（pg/mg protein，-x±s）

2.4 虫草素对D-gal联合AlCl3诱导AD小鼠脑组织氧化应激的影响 与空白组相比，模型组MDA水平升高，SOD、POD和CAT水平降低（P均＜0.05）；与模型组相比，虫草素高剂量组MDA水平降低，CAT活力升高（P均＜0.05）；与模型组相比，虫草素中、低剂量组SOD、POD和CAT活力均升高（P均＜0.05）；与模型组相比，多奈哌齐组MDA水平降低，SOD、POD和CAT活力均升高（P均＜0.05）。见表4。

表4 各组小鼠脑组织氧化应激指标比较（-x±s）

3 讨论

虫草素具有显著的抗氧化和抗炎作用，可以改善肾缺血再灌注损伤、对抗脂多糖诱导的肺损伤等［7］。近年有研究报道，虫草素通过抗氧化、抗炎也具有神经保护作用［8］。虫草素（24 mg/kg）能明显改善糖尿病小鼠的认知功能，并减轻脑组织的氧化应激损伤［9］。D-gal具有神经毒性，在脑组织中大量聚积，能使细胞渗透压升高，细胞内活性氧增多，脑功能退化，诱导亚急性衰老模型［10］。铝是天然存在的有毒微量元素，慢性长期给予AlCl3可致机体脑内乙酰胆碱酯酶活性增加，诱导氧化损伤，导致认知功能障碍［11］。AlCl3和D-gal联用能明显增强两者的神经毒性，为国内外广泛认可的、良好的AD模型诱导方法［12］。本研究以此方法诱导小鼠AD模型，探讨虫草素在AD中的确切作用和机制。本研究发现，9周后，模型组小鼠的认知功能下降，AD造模成功。给予与文献相似剂量的虫草素［9］干预的小鼠认知功能明显改善，从而确认了虫草素对AlCl3联合D-gal诱导AD的保护作用。Aβ沉积形成的老年斑是AD的特征性病理学改变之一。“β淀粉样假说”认为，Aβ沉积是AD发病的主要因素［13］。D-gal和AlCl3联用可使小鼠体内β-分泌酶（BACE）和γ-分泌酶水平升高，两种酶可作用于APP产生Aβ，而Aβ可以与乙醇脱氢酶反应产生活性氧，使线粒体功能异常，活性氧可通过激活各种信号通路，进一步使APP代谢异常，导致Aβ异常产生和积累［14］。虽然已有实验证实，虫草素可减轻Aβ或Aβ联合D-gal诱导的神经损伤［5，15］，但对虫草素是否调控Aβ的水平还未见报道。本实验中，模型组Aβ1-40与Aβ1-42水平较空白组高，表明二者联用诱导了Aβ在小鼠脑组织中的异常累积。应用虫草素后，部分Aβ1-40与Aβ1-42水平下降，说明虫草素可能不仅能减轻Aβ诱导的神经毒性，也可调控其表达，但具体的机制还有待进一步研究。

神经炎性反应被认为是AD发病的重要因素之一，炎症因子还可诱导氧化应激，促进神经元损伤，从而加速AD病情进展［16］。D-gal和AlCl3联用可通过异常累积的Aβ激活神经小胶质细胞，释放大量炎症因子，包括IL-1、TNF-α、IL-6、补体等，促进AD脑内的炎症反应。其中IL-6参与了AD患者脑内老年斑的形成，在AD发病过程中发挥重要作用［17］。本研究发现，模型组小鼠大脑皮层和海马中的IL-6炎症因子水平升高，虫草素中、高剂量组IL-6水平降低，说明虫草素的抗AD作用可能与其抗炎、降低IL-6水平有关。

众所周知，氧化应激能增强Aβ介导的神经毒性，促进AD发生［18-19］。本研究结果显示，D-gal和AlCl3联合处理可诱导小鼠氧化应激，明显升高氧化损伤产物——MDA水平，而抗氧化标志物——SOD、CAT和POD活力下降，这与文献［20］结果一致。给予虫草素处理后，氧化应激生物标志物的不平衡则被逆转，小鼠大脑皮质中的MAD水平降低，SOD、CAT、POD水平均有不同程度升高。表明虫草素可降低D-gal联合AlCl3诱导AD小鼠的氧化应激损伤，从而发挥神经保护、改善AD的作用。

多奈哌齐是第二代胆碱酯酶抑制剂，是目前临床应用的AD治疗药物，因此本实验选用该药物作为阳性对照。结果显示，虫草素与多奈哌齐具有相似的改善AD小鼠认知的作用。多奈哌齐通过提高患者脑组织中乙酰胆碱的水平、减轻Aβ的神经毒性、抗氧化和抗炎等多种机制发挥对神经元的保护作用［21］。本研究结果显示，虫草素在降低Aβ水平、抗氧化、抗炎方面与多奈哌齐相似。这进一步证实了虫草素良好的改善AD的作用。但本实验中一些指标未呈现明显的剂量依赖关系，这可能与本实验所应用的虫草素剂量跨度偏小、不同剂量发挥的作用可能存在差异有关，具体的机制还有待进一步研究。

综上，虫草素能改善D-gal联合AlCl3诱导AD小鼠的认知功能，其机制可能与抗炎、抗氧化、降低Aβ水平有关。可见，虫草素具有潜在的抗AD作用，具有良好的药用开发前景。

利益声明所有作者声明不存在利益冲突

作者贡献声明彭达，赵爽：实验设计及实施，论文撰写；宋润蔚，公元，韩冷，宗闰喆：参与实验实施；张继国，田华：指导实验设计；王浩：指导论文的撰写