应用浮游植物荧光仪和化学分类法预测水库水华风险

余小青

（厦门市政南方海洋科技有限公司，福建 厦门 361000）

1 研究背景

我国有近10 万座水库，是世界上水库数量最多的国家。近年来，由于地下水不足以及河流污染日趋严重，远离大城市的水库成为重要的饮用水水源，且呈逐年增加的趋势[1]。福建省拥有饮用水源地接近600 个，水库型水源地就占到了50%多，闽南“金三角”厦门、漳州、泉州的饮用水源平均62%以上为水库型。然而，现今供水水库面临的最突出问题即富营养化，严重制约经济社会的可持续发展并威胁水生态健康与供水安全。水库富营养化起因于人类活动导致氮（N）和磷（P）的过量输入，严重的可产生水华、毒素、异味等。为了保障饮用水安全，保护饮用水水源生态健康，加强富营养化与浮游植物水华防治已刻不容缓[2]。

浮游植物是水库生态系统的重要功能类群，对水生态系统物质循环和能量流动起承上启下的关键作用，另外在维持生态系统结构和功能稳定性方面也发挥着重要作用。同时，浮游植物又是敏感类群，是分析富营养过程可逆性的良好材料。国内水库监测多采用理化参数分析，但是，大部分水华污染事故表明，常规理化参数在水华爆发前期不会发生明显变化，难以起到预警作用。

因此，对水库浮游植物进行长期跟踪研究和观测能够为水体富营养化治理、水华预警、生态保护、环境重建等提供基础资料和科学依据，在理论和实践上均具有重要意义。

2 国内外研究现状及发展动态分析

2.1 水库浮游植物群落研究需进一步加强

水库作为一种新型的水源地，在全球范围内成为重要的供水水体时间较短，尽管在水文、水动力等方面已经积累大量数据，但是水库微型生物多样性与生态数据却十分缺乏[1]。浮游植物是水生态系统的重要初级生产者，其作为食物网结构中的基础环节，在水体生态系统的物质循环和能量转化过程中起着重要作用。另外，浮游植物作为生物监测的对象之一，可以通过其种类组成、结构、现存生物量指标来综合反映水质的功能，而且自身的状态也直接影响着水生生物的生存状态。

浮游植物的光合作用和叶绿素荧光特性是反映浮游植物生长状态的最佳指标，可以很好地反映出浮游植物对环境变化的响应，对控制和预测水华具有重要的意义。通常，发生水华事件一般要具备两个条件：1）水体中叶绿素a 的浓度要超过10 μg/L[3]；2）某一两种浮游植物细胞数占的比例急剧上升，水体中生物多样性指数大幅下降。因此，通过浮游植物群落丰度和光合活性的监测能较直观的预测水华的发生。

2.2 浮游植物群落结构的化学分类法

浮游植物作为水库生态系统的重要组成部分，其群落组成是评估水生态系统健康及水质优劣的重要指标，对于水华防治来说意义重大。基于色素的化学分类法已广泛应用于海洋环境，但淡水环境的应用仍有待进一步发展。叶绿素a 是浮游植物重要的生物标志物，作为浮游植物生物量的指示物在世界范围己被认同和使用了超过80 年。浮游植物色素可被分为三种：叶绿素、类胡萝卜素（胡萝卜素及其降解产物）和藻胆蛋白（异藻蓝蛋白、藻蓝蛋白、藻红蛋白等）。不同的浮游植物有其特征色素（见表1），因而能够利用色素的生物标志特性来研究和表征浮游植物群落结构[4]。

表1 浮游植物的主要特征色素（引自Jeffery et al.1997）[4]

采用高效液相色谱（HPLC）将不同的色素分离，利用浮游植物和色素之间的化学分类学联系来“解色素数据”。它能够对几乎所有的浮游植物进行分类，可以通过特征色素的被检出来判断微型浮游植物的存在，也特别适合大批量样品的快速分析，是目前对浮游植物群落结构进行宏观分析的有效方法。Mackey等[5]开发了一种能利用计算机进行自动计算、优化处理的浮游植物色素分析程序（CHEMTAX），并将其运用到了使用色素表征浮游植物群落结构的研究中，使得浮游植物的化学分类法趋于成熟并被广泛应用到极地、大洋、近海、河口、湖泊等区域的浮游植物群落结构研究中。近二十几年来，HPLC/CHEMTAX 的应用日益广泛，并且经众多科学家将其与显微镜细胞计数、分光光度法和荧光法、流式细胞仪等方法的对比分析，均获得了一定程度的一致性。

2.3 浮游植物的叶绿素荧光特性

浮游植物的光合作用是指叶绿体中的叶绿素吸收光，并将光能转化为化学能的过程。它主要包括光反应和暗反应两个阶段，是浮游植物最基本的生理过程。叶绿素吸收的光能最终以3 种形式存在：光合作用、叶绿素的自发荧光和热耗散。光合作用利用到的能量只是叶绿素吸收光能的其中一部分，不能被利用的部分光能则会以热能和叶绿素自发荧光的形式散发出去。由于这三部分能量之间存在着相互竞争的关系，因此，叶绿素自发荧光的变化能够反映出浮游植物光合作用的变化。当光合作用速率高时，叶绿素放出的荧光较弱，光合作用速率低时，放出的荧光较强。因此，叶绿素荧光特性是反映叶绿体状态以及光合作用效率的重要参数。

叶绿素的荧光随时间变化的曲线被称为叶绿素荧光诱导动力学曲线。叶绿素荧光动力学特性能够反映出光合作用过程的丰富信息，包括光能的吸收与转换、能量的传递与分配、反应中心的状态等。叶绿素荧光动力学以植物体内叶绿素为探针，可以对光合器官进行无损伤探测，获得原位信息，是研究和探测浮游植物的营养状况、生理状况、病害状况和受胁迫程度的新型活体测定和诊断方法，具有快速、灵敏、对细胞无损伤的优点。大量研究表明，当植物受到胁迫时，光化学反应下降，而热耗散和叶绿素荧光形式的耗散增加，因此叶绿素荧光的变化可以反映浮游植物受胁迫的情况[6]。在荧光分析中最常用的参数是Fv/Fm值，Fv/Fm=（Fm-F0）/Fm是光系统Ⅱ（PSⅡ）的最大光化学产量，反映了PSⅡ的最大光能转化效率。在非胁迫条件下此参数变化很小，但在胁迫条件下，比如高光强、病虫害、盐胁迫、水胁迫等，Fv/Fm变化较大，因此它也是反映浮游植物生长环境良好与否的一个重要参数。

2.4 浮游植物分类荧光仪的应用

基于荧光参数与叶绿素含量在一定范围内成正比，通过校正可测出叶绿素含量的原理，浮游植物分类荧光仪利用调制叶绿素荧光技术测量水体中蓝藻、硅/甲藻和绿藻的叶绿素的含量，以及水体中这些浮游植物光合作用的速率，进而反映出浮游植物细胞的“生长潜能”等。

德国Walz 公司生产的浮游植物荧光仪Phyto-PAM（Phytoplankton Pulse-Amplitude-Modulatio）采用脉冲-振幅-调制技术，利用4 种不同波长（蓝色470 nm、绿色520 nm、浅红色645 nm 和深红色665 nm）的led 作为光源，发射微秒级的测量光脉冲，利用光电倍增管作为检测器，获得4 种波长的光激发出的半同步的荧光信号。结合不同浮游植物门类的参考光谱（reference spectrum）进而区分不同藻类的光合活性和叶绿素含量。Phyto-PAM 可根据浮游植物不同门类的捕光色素对光谱的吸收特性，自动对自然水样中的蓝藻、硅/甲藻和绿藻进行定性分类；基于荧光参数与叶绿素含量在一定范围内成正比，通过校正可定量测量蓝藻、硅/甲藻和绿藻各自的叶绿素a 浓度以及水样的总叶绿素a 浓度；通过水样中蓝藻、绿藻、硅/甲藻的荧光参数特性，计算藻细胞的光合作用活性及“生长潜能”。因此，Phyto-PAM 可用于快速无损地测定不同门类的浮游植物（如蓝藻、硅/甲藻和绿藻）的光合生产、光能利用效率等，并可用于确定水体中不同门类浮游植物的叶绿素含量。在过去的十几年里，广泛的应用于河流，湖泊，海洋等水体浮游植物光合作用的研究中。

Phyto-PAM 不仅可以对水体样品的藻类进行定性分类，鉴别出所含的蓝藻、硅/甲藻和绿藻，还可以定量测量出水体所含的叶绿素a 含量，就可以对水华发生时不同浮游植物类群进行分析。此外，通过测定叶绿素荧光，可以得到Fo、Fm、Fv、Fv/Fm、PSⅡ、rETR 等荧光参数，并可以用于测量水样的光响应曲线。Phyto-PAM 的优点在于：简单、快速，测量一个样品只需20 s 即可；可以现场测量，及时拿到数据，没有延迟性；除了总叶绿素a 数据外，还有蓝藻、绿藻、硅/甲藻的叶绿素a 数据。由于测量快速，可以大大增加采样站位数和水体的分层数。相对于传统方法来说，可以大大提高数据对水体的代表性。暗适应15 min 后测量的Fv/Fm值是PSⅡ的最大量子产量，很好的反映了藻细胞的潜在最大光合能力（光合效率），是反映藻细胞生理的最核心指标。就藻细胞的生长而言，在细胞数暴增之前，Fv/Fm肯定要先升高；当植物受到胁迫时，Fv/Fm显著下降。以前利用传统的测量方法研究光合作用最快也要1 d～2 d 才能得出结果，降低了生物监测的时效性。

3 水库水华预警研究建议

富营养化水库浮游植物水华预警的研究是一项具有挑战性的任务，需要各种各样的技术和方法。化学分类法中的利用HPLC/CHEMTAX 测定分析浮游植物的光合色素为快速准确捕捉富营养化过程中浮游植物群落结构变化提供了良好的技术方法，是目前对浮游植物群落结构进行宏观分析的有效方法。利用叶绿素荧光技术测量水体中浮游植物的光合作用活性，可以反映浮游植物的光能吸收和光化学反应等光合作用的原初反应过程，可以研究环境因子对浮游植物光合作用和生长的影响，可以长期监测自然水体中不同类群浮游植物光合作用潜力的变化趋势，为深入研究浮游植物光合作用对富营养化的响应提供有力的技术支撑，这对于水华的预警预测具有很大的参考价值。

水华的爆发是在富营养、高光、高温等特定的环境条件下，浮游植物的光合作用速率高，藻细胞短期快速暴增而形成的。水质常规监测中，除了水质理化指标外，只关注叶绿素a 含量可以了解的是当前水体中浮游植物的生物总量；而关注浮游植物的光合作用活性可以了解浮游植物的生长潜能。如果水体中营养盐含量较低，富营养化指数不高，即使当前浮游植物生物量高，也不具备发生水华的可能；但如果在富营养条件且高光高温下，即使当前浮游植物生物量不高，而浮游植物的光合作用活性强，就具有极大的发生水华的可能。对淡水环境监测而言，更应关注蓝藻水华。利用HPLC 化学分类法及Phyto-PAM 可以快速测量分析水中浮游植物的优势种是否是蓝藻，并可对水体中蓝藻的生长趋势进行预测，是有效预防蓝藻水华的手段之一。

因此，应用基于HPLC 的化学分类法及调制叶绿素荧光分析手段获得水库浮游植物群落结构特征及优势浮游植物的荧光特性，将水库富营养化、浮游植物群落结构、浮游植物光合作用三者关联起来，从生态角度综合分析水库浮游植物对富营养化的响应，是水库水华预警研究和运用的一个重点方向。

针对水库富营养化严重的问题，开展水库水华风险预警关键技术研究，为水库水安全保障提供技术支持，具有十分重要的现实意义。建议，首先可对水库平水期和枯水期的生物、化学、物理性质认定，以识别水库营养盐水平、优势浮游植物及其光合活性；其次，优选水库富营养化的关键参数，鉴定水库水华风险级别；最后，基于水库富营养化特征、浮游植物优势类群及光合活性特征，建立水库水华风险综合预警技术。