乳制品中类固醇激素类化合物检测研究进展

邢倩倩，刘振民，游春苹,

（1.乳业生物技术国家重点实验室，上海乳业生物工程技术研究中心，光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海 200436；2.江南大学 食品营养与安全协同创新中心，江苏 无锡 214122）

乳制品作为代表性的动物源食品，能够提供人体必需的脂肪、蛋白质、维生素和矿物质等。随着经济发展和人民生活水平的提高，人类对乳制品的需求量急剧增加，乳制品安全问题，尤其是兽药残留问题已成为人们关注的焦点[1-2]。兽药残留是指动物在应用兽药（包括兽药添加剂）后，蓄积或贮存在细胞、组织或器官内，或进入泌乳动物的乳或产蛋家禽蛋中的药物以及有毒理学意义的代谢物和药物杂质[3-5]。随着科技和经济的发展，畜牧业和养殖业逐渐转向现代集约化和规模化，为了提高经济效益，类固醇激素可能作为促生长剂被违法添加，用于畜牧业和养殖业增加动物体质量、提高饲料转化率等[6-7]。

类固醇激素又称甾体激素，是一种亲脂性的小分子物质，主要由内分泌腺和分散在其他器官的内分泌细胞等特定器官分泌，是一种微量生物活性物质。类固醇激素通过血液运输到其他器官，有调节、控制组织器官生理活动和代谢机能的作用，并对各种生理机能和代谢过程起着重要的协调作用。乳制品中残留激素通过食物链进入人体会产生一系列健康危害，如导致代谢失调、生长发育障碍和缺陷、出生缺陷、致癌、致畸等[8-9]。乳制品中类固醇激素的残留在国内外已成为兽药残留问题关注的重点。

目前已有针对激素残留对消费者健康潜在风险的研究。越来越多的证据表明，即使是接触微量的激素类物质，也可能对动物和人类构成潜在风险。雄激素和孕激素均被认为是可能对人类致癌的物质。欧盟1996年明令禁止畜牧业使用具有促生长作用的激素。我国2019年颁布中华人民共和国农业农村部公告第250号法令，禁止合成类固醇激素在食品动物中的应用。因此，为保护人类健康免受激素的危害，应采取适当的措施检测动物基质中这些化合物的含量。已经有研究检测了多种生物基质，如牛乳、肉、血清、头发、皮肤、脂肪和血浆中的激素含量[10-12]。乳制品作为广泛食用的食品，是研究最多的基质之一。

1 类固醇激素的结构、分类及其功能

类固醇激素结构源于胆固醇，其结构如图1所示，由3 个六元环和1 个五元环构成，通过六元环-六元环-六元环-五元环的方式排列。类固醇激素结构以该类化学骨架为基础，通过链断裂、开环或环收缩形成其他骨架，同样是C18和C19位置有2 个甲基，胆固醇脱掉部分侧链即为21 个碳原子的类固醇激素-孕激素和肾上腺皮质激素，胆固醇脱掉整个侧链即为19 个碳原子的类固醇激素雄性激素，胆固醇脱掉C18位置甲基，第1个六元环转化为芳香酚结构形成雌激素；类固醇激素的结构区别主要在于环形结构上的官能团和环形结构的氧化态，同时，类固醇结构中官能团的立体异构性决定了不同的生物活性，如α-雌二醇和β-雌三醇[13]。

图1 胆固醇化学结构Fig.1 Chemical structure of cholesterol

根据生物活性和药理作用类固醇激素可分为两大类：性激素和肾上腺皮质激素（表1）。性激素是由动物性腺、肾上腺和调控器官产生，可促进第二性征发育、性别差异、维持性功能和促进动物体代谢。性激素可细分为雌激素、雄激素和孕激素。肾上腺皮质激素主要是由哺乳动物脊椎肾上腺皮层产生，可细分为盐皮质激素和糖皮质激素。乳制品生产加工过程中主要涉及糖皮质激素，如氢化可的松、泼尼松龙和地塞米松等。

表1 类固醇激素分类及代表性激素[5,13-14]Table 1 Classification and representatives of steroid hormones[5,13-14]

类固醇激素按照来源可分为人工合成类和天然类两大类。天然类固醇激素主要由动物的雌性、雄性性器官和肾上腺素器官产生，是影响动物生长发育的重要物质之一。天然类固醇激素和人工合成类固醇激素均可分为雄激素、雌激素和孕激素。天然激素，如雌二醇、睾酮或孕酮通过口服或肠道外给药会失效。人工合成类固醇激素主要用于治疗器官病变导致的疾病或用于促进生长发育。人工合成类固醇激素的给药途径与天然激素不同，该类激素通常以酯衍生物的形式通过肌肉注射或耳朵附近植入给药，经过吸收、水解或异构化后，易在体液中转运至外周血；人工合成类固醇激素在动物体内很难分解，通过食物链进入人体后，可扰乱人体内分泌系统[14]。

2 乳制品中类固醇激素限量标准

美国、英国、中国等国家均规定了动物源性食品中糖皮质激素的最大残留量，部分糖皮质激素还被规定为违禁药物[15]。欧盟规定，牛的肌肉、肝脏、肾脏和牛乳中泼尼松龙的最大残留限量分别为4、10、10、6 µg/kg。2020年发布的中华人民共和国农业农村部公告235号法令《动物性食品中兽药最高残留限量》规定，地塞米松在牛、猪、马的肌肉和肾脏中的最大残留限量为0.75 µg/kg，在肝脏中的最大残留限量为0.75 µg/kg，在牛乳中的最大残留限量为0.3 µg/kg[16]。欧盟禁止在食用动物中使用氢化可的松。中国、欧盟和国际食品法典委员会并未对牛乳和其他乳制品中的氢化可的松残留量设定限值。日本已制定法规要求，食品中氢化可的松的最大残留限量为10 µg/kg。

国际食品法典委员会对醋酸甲羟孕酮在动物肝脏中的最大残留限量设定为10 µg/kg，对牛乳中睾酮、孕酮的最大残留限量未作限制。美国食品药品监督管理局、欧盟规定，雌激素不可以作为促生长剂在畜牧业中使用。中华人民共和国农业农村部公告235号法令明确规定：醋酸甲羟孕酮、甲基睾丸酮等为禁用兽药；苯甲酸雌二醇、丙酸睾酮为治疗允许药物，但不得在牛乳中检出；雌二醇等雌激素列为禁用药物，食品中不得检出。世界卫生组织根据200 mg/d（3.3 mg/kg体质量）的最低观察效应水平得出孕酮的可接受每日摄入量（acceptable daily intake，ADI）为30 µg/kg体质量[15]。不同国家、机构针对牛乳中激素允许的最大残留限量见表2。

表2 中国、美国、欧盟、国际食品法典委员会和日本对牛乳中激素的最大残留限量比较Table 2 Maximum residue limits for hormones in milk in China, USA,EU, Codex Aalimentarius Commission and Japanµg/kg

3 乳制品中类固醇激素检测方法

国内外针对乳制品中类固醇激素的研究较多[17-19]，本节主要讨论检测方法中的前处理方法和仪器方法。

由于乳制品样品基质的复杂性，乳制品中类固醇激素的前处理方法主要包括固相萃取、固相微萃取、基质固相分散和QuEChERS（quick, easy, cheap, effective,rugged, safe）等[20-24]。

类固醇激素的检测方法主要为酶联免疫法和色谱分析法，其中酶联免疫法假阳性率高，只能用于定性初筛[25]。Kolanvic等[26]验证了酶联免疫法筛查对牛乳中地塞米松、倍他米松、氟米松和泼尼松龙4 种激素的有效性。色谱分析法可用于类固醇激素的精准定量，主要包括高效液相色谱-串联紫外色谱法、高效液相色谱-串联质谱法和气相色谱-串联质谱法[27]。Qin Hui等[28]采用高效液相色谱-串联紫外色谱法分析牛乳样品中的3 种肾上腺皮质激素（二丙酸倍氯米松、丁酸氢化可的松和苯丙酸诺龙）。刘东等[29]采用通过式固相萃取对牛乳和乳粉中4 种类固醇激素进行前处理，然后采用高效液相色谱-串联质谱法测定牛乳和乳粉中4 种类固醇激素，检出限为0.4～2.0 µg/kg，定量限为0.8～4.0 µg/kg，加标回收率为85%～115%。田海伟等[30]通过QuEChERS前处理方法，实现牛乳中18 种糖皮质激素的同时检测，然后通过高效液相色谱-串联质谱在多反应监测模式下进行定性和定量分析，实现牛乳中18 种糖皮质激素的同时检测。该方法的基质效应为0.81～0.96，方法检出限为0.1～0.3 µg/kg，定量限为0.3～1.1 µg/kg，0.5～100.0 ng/mL质量浓度范围内呈线性关系，3 个水平下加标回收率为73.7%～98.6%，相对标准偏差为4.9%～12.9%（n=5）。该方法简单、快捷、准确、可靠，适合于大批量牛乳样品中糖皮质激素的快速检测。D’Orazio等[31]采用中空纤维液相微萃取法及气相色谱-三重四极杆质谱法测定牛乳和酸乳样品中的雌激素化合物，方法校准曲线的相关系数大于0.991，全脂牛乳的检测限和定量限分别为0.06～2.55 µg/L和0.16～6.11 µg/L，半脱脂山羊乳的检测限和定量限分别为0.04～1.70 µg/L和0.11～4.86 µg/L，天然酸乳的检测限和定量限分别为0.07～3.73 µg/L和0.23～9.81 µg/L。

色谱分析法检测准确、重现性好，尤其是液相色谱-串联质谱法是目前类固醇激素的标准检测方法。现有的3 项有关类固醇激素的检测标准：GB/T 21981—2008《动物源食品中激素多残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》，农业部1031号公告-1—2008《动物源性食品中11 种激素残留检测 液相色谱-串联质谱法》和农业部1031号公告-2—2008《动物源性食品中糖皮质激素类药物多残留检测 液相色谱-串联质谱法》均采用液相色谱-串联质谱法完成定量。

4 乳制品中类固醇激素含量研究进展

Chen Chen等[32]对北京市售乳制品中天然存在的雌激素含量展开研究，选择26 个品类超高温灭菌（ultrahigh temperature，UHT）乳、4 个品类巴氏杀菌乳、6 个品类婴幼儿配方乳粉和2 个品类全脂乳粉。结果表明：不同乳制品中雌酮含量为：UHT牛乳3.52～19.36 ng/L，巴氏杀菌乳小于检测限，为22.49 ng/L，婴儿配方乳粉26.78～146.12 ng/L，全脂乳粉10.35～10.38 ng/L；17α-雌二醇含量为：UHT牛乳0.95～12.61 ng/L，巴氏杀菌乳小于检测限，为28.24 ng/L，婴儿配方乳粉7.98～35.00 ng/L，全脂乳粉24.27～28.34 ng/L；17β-雌二醇含量为：UHT牛乳小于检测限，为36.00 ng/L，巴氏杀菌乳小于检测限，为44.24 ng/L，婴儿配方乳粉19.16～37.72 ng/L，全脂乳粉58.59～70.12 ng/L；雌三醇含量为：UHT牛乳小于检测限，为2.18 ng/L，巴氏杀菌乳、婴儿配方乳粉和全脂乳粉均小于检测限。陈晓鹏等[16,33]采用QuEChERS结合超高效液相色谱-串联质谱技术分别对中国市场销售的24 个乳粉样品和24 个牛乳样品进行42 种类固醇激素残留量检测，结果显示，48 个乳制品中除了孕酮外其他41 种类固醇激素均未检出，其中乳粉中孕酮的检出量为0.6～23.8 µg/kg，牛乳中孕酮的检出量为0.3～0.8 µg/kg。韩超男等[34]采用同位素稀释-超高效液相色谱-串联质谱法完成20 份牛乳中睾酮、孕酮及氢化可的松3 种类固醇激素的检测，20 份牛乳样品中均含有孕酮，含量为1.33～16.19 µg/kg，19 份牛乳样品中检出氢化可的松，含量为0.14～1.02 µg/kg，未超出国家规定的10 µg/kg限量标准，样品均未检出睾酮。康占省[35]建立凝胶净化色谱-超快速液相色谱-串联质谱法测定乳粉中的泼尼松、波尼松龙、氢化可的松、地塞米松和倍他米松含量，15 种乳粉中均未检测到以上化合物；建立婴幼儿配方乳粉中6 种雌激素（已烯雌酚、17α-乙炔基雌二醇、17α-雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇和雌酮）的气相色谱-质谱分析方法，26 份婴幼儿配方乳粉中17α-雌二醇的含量为0.10～4.49 µg/kg，1 个样品中检出17β-雌二醇，含量为0.17 µg/kg，3 个样品中检出雌三醇，含量均为0.19 µg/kg，未检出己烯雌酚、雌酮和炔雌醇。

不同乳制品中类固醇激素含量见表3。

表3 不同乳制品中类固醇激素含量Table 3 Contents of steroid hormones in different dairy products

5 乳制品中类固醇激素健康风险研究

乳制品中的激素对人体内分泌系统生理功能会有一定影响，已引起科研界和工业界的关注[37]。在乳制品中类固醇激素对健康风险研究方面，已有一些研究报道可供参考。Qu Xueyin等[36]对河北省唐山市原料乳中天然存在的类固醇激素健康风险开展调查。基于该研究所得数据，当暴露于该研究中检测的牛乳中类固醇激素（仅检测到氢化可的松和孕酮）浓度时，预计1～5 岁的儿童将成为高危人群。根据牛乳中检测到的氢化可的松孕酮平均浓度和最大浓度，以及男孩和女孩每日摄入量估算，结果表明，所检测的原料乳中类固醇激素浓度不会对幼儿构成健康风险。Chen Chen等[32]对北京市售乳制品中天然存在的雌激素的潜在暴露风险开展初步评估。基于所检测的不同乳制品中雌酮、17α-雌二醇、17β-雌二醇和雌三醇浓度计算出通过牛乳摄入的雌激素暴露量和毒理学关注阈值分别为99～1 700 000和6.1～3 177，以确定来自牛乳的雌激素摄入量是否符合毒理学限制要求。结果表明，牛乳中可能存在的单个雌激素和总雌激素不会对当地居民（包括幼儿）造成健康风险。

6 结 语

本文系统介绍了类固醇激素的结构、分类及功能，乳制品中类固醇激素检测方法、限量标准、含量及健康风险研究进展。随着高效前处理技术和检测技术的发展，类固醇激素检测方法近些年有较大突破。近年来，QuEChERS前处理方法结合超高效液相色谱-串联质谱法成为使用最广泛的技术。乳制品中类固醇含量较低，开发高灵敏度的检测方法仍是今后主要研究目标。

近期研究主要基于美国、欧盟、中国等国家和组织针对类固醇激素所制定的限量标准，根据所检测乳制品中类固醇激素含量，研究不同人群的暴露风险。由于乳制品中类固醇激素检出类别较少，暴露风险评估覆盖面较小。开发具有高灵敏度的检测方法，可增加类固醇激素的检出类别，进而增加暴露风险评估覆盖面。