IL-6基因多态性与环境因素对原因不明复发性流产的交互影响①

杨丽萍 毛宝宏 刘倩 王燕侠 李静 代志蓉 李亚梅④

（甘肃省中医院公共卫生与医院感染管理处，兰州730050）

复 发 性 流 产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指在妊娠28周之前有2次以上的胎儿丢失，影响着2%~5%的育龄期女性［1］。RSA在临床上缺乏特异性且致病原因复杂，主要与遗传、解剖、内分泌、感染、免疫、环境等因素密切相关，目前仍有50%的RSA患者原因未明［2］。有研究表明，Th1/Th2细胞平衡对母体免疫耐受和妊娠维持至关重要［3］。单核/巨噬细胞产生的促炎细胞因子在脂质代谢、凝血、胰岛素抵抗等方面的多功能作用均与原因不明复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）有关，而IL-6作为Th2细胞因子，在促进胚胎着床、下调细胞免疫反应以及维持妊娠方面具有重要意义［4］。尽管国内外已有部分研究涉及IL-6基因多态性与URSA的关系，但研究结论尚不一致，且未进行环境-基因交互作用分析［5-6］。因此，本研究采用病例对照的研究方法，探讨甘肃兰州地区育龄期女性IL-6相关基因单核苷酸多态性（single nucleo⁃tide polymorphism，SNP）及环境危险因素与URSA的遗传易感性，以期为临床基因筛查和预防策略的制定提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象以2019年1月至2020年8月在甘肃省妇幼保健院复发性流产门诊就诊的150例URSA患者为病例组，入选标准：①因胚胎停止发育导致2次及2次以上URSA者；②甲状腺激素、胰岛素、性激素等内分泌检查正常；③月经周期及排卵正常；④生殖系统解剖结构正常且无细菌、支原体、病毒等感染者；⑤免疫学相关抗体筛查（抗心磷脂抗体、抗核抗体、抗甲状腺球蛋白抗体、抗β2-糖蛋白Ⅰ抗体）正常；⑥丈夫精液分析正常。排除标准：①患有甲状腺及肝肾功能性疾病者；②凝血功能异常者；③染色体及生殖系统异常者；④其他由遗传、免疫、感染等因素导致的流产。选取同期在本院体检的150例健康女性为对照组，入选标准：①至少成功分娩过1胎的育龄期女性；②无RSA及死胎、死产史；③生殖系统解剖结构正常且无遗传、内分泌异常和感染。

1.1.2 主要试剂与仪器全自动核酸纯化仪HF16 Plus［恺硕生物科技（厦门）有限公司］；2720型PCR扩增仪（ABI）；虾碱酶（Promega）；外切酶Ⅰ（Epicentre）；SNaPshot Multiplex Kit（ABI）；FR-110紫外分析仪、FR-250电泳仪（上海复日科技有限公司）；凝胶成像仪（上海培清科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 基线调查方法经甘肃省妇幼保健院伦理委员会批准后，研究对象在自愿参与的基础上，由统一培训的专职医务人员以面对面询问的形式现场填写调查表，获取一般人口学特征、生理生育史、环境暴露史及相关生活行为特征。同时采集每位研究对象外周血3 ml，于2 h内入库深低温（-80℃）储存。

1.2.2 DNA提取①在2.0 ml样品管内加入40μl蛋白酶K溶液（10 mg/ml），再加入400μl解冻后的全血样本进行预处理；②严格按照相关操作步骤，利用全自动核酸纯化仪HF16 Plus及其配套试剂盒进行全自动DNA提取；③使用分光光度计检测提取DNA浓 度 和 纯 度，DNA浓 度>20 ng/μl表 明 提 取成功。

1.2.3 基因分型本研究采用SNaPshot多重SNP分型技术对rs1800796位点进行基因分型检测。SNaPshot多重SNP分型技术由美国应用生物公司（ABI）开发的一种基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序，主要用于中等通量的SNP分型，其优势为分型准确、通量高、检测速度快，且不受样本个数与SNP位点多态性特性限制。引物用在线Primer3软件设计（http：//bioinfo.ut.ee/prim⁃er3-0.4.0/），引物序列及长度见表1。具体基因分型过程如下：①PCR扩增：在PCR扩增仪上进行扩增，程序如下：95℃2 min；94℃20 s，65℃（-0.5℃/循环）40 s，72℃1.5 min，11个循环；94℃20 s，59℃30 s，72℃2 min，24个循环；72℃2 min。将5 U虾碱酶和2 U外切酶Ⅰ加入10μl PCR产物中，37℃温浴1 h，然后75℃灭活15 min进行纯化。②SNaPshot多重单碱基延伸反应：延伸反应体系（10μl）包括5μl SNaPshot Multiplex Kit（ABI），2μl纯化后多重PCR产物，1μl延伸引物混合物，2μl超纯水。程序如下：96℃1 min；96℃10 s，55℃5 s，60℃30 s，28个循环。然后在10μl延伸产物中加入1 U SAP酶，37℃温浴1 h，75℃灭活15 min进行纯化。③测序检测：取0.5μl纯化后的延伸产物，与0.5μl Liz120 SIZE STANDARD、9μl Hi-Di混匀，95℃变性5 min后用ABI3730XL测序仪进行测序，测序仪上收集的原始数据用GeneMapper 4.1软件进行分析。

表1 扩增的SNP引物序列Tab.1 Primer sequence of amplified SNP

1.3 统计学分析以SAS9.4软件建立数据库进行统计分析。采用χ2检验完成组间一般特征分布及Hardy-Weinberg遗传平衡检验。利用非条件Logis⁃tics回归模型分析IL-6基因SNP位点及环境因素与URSA的关系。基于叉生分析法用相乘交互作用模型探讨环境-基因交互作用对URSA的影响。检验水准α取值0.05。

2 结果

2.1 一般情况本研究共纳入研究对象300例，其中URSA组150例，对照组150例。经均衡性检验，两组在年龄、文化程度、家庭人均月收入、居住地、工作类别等方面差异有统计学意义（P<0.05），URSA人群文化程度与家庭人均月收入普遍较低，以农村人口居多，且多数从事中度以上体力劳动，详见表2。

表2 研究对象一般特征分布［例（%）］Tab.2 Distribution of basic characteristics of study population［n（%）］

2.2 IL-6基因rs1800796位点基因多态性与URSA易感性的关联经检验，两组人群IL-6基因rs1800796位点基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（P<0.05）。在共显性模型中，与CC基因型相比，携带GC基因型女性发生URSA的风险增加1.91倍（OR=1.91，95%CI：1.09~3.36），携带GG基因型女性发生URSA的风险增加1.54倍（OR=1.54，95%CI：1.02~2.34）。显性遗传模型分析显示，与未携带G等位基因女性相比，携带G等位基因发生URSA的风险增加2.03倍（OR=2.03，95%CI：1.18~3.47）。隐性遗传模型分析显示，组间基因型分布差异无统计学意义。按流产次数进一步进行分层分析，结果显示在共显性遗传模型、显性遗传模型及隐性遗传模型中，G等位基因携带者均不增加2次RSA的发病风险（OR=1.44，95%CI：0.92~2.26；OR=2.05，95%CI：0.95~3.47；OR=1.49，95%CI：0.68~3.26），但显著增加3次以上RSA的发生风险（OR=2.46，95%CI：1.17~5.13；OR=2.15，95%CI：1.17~3.61；OR=2.15，95%CI：1.10~8.97），见表3。

表3 rs1800796位点SNP与URSA易感性的关系Tab.3 Association between rs1800796 SNP and risk of URSA

2.3 IL-6基因rs1800796位点基因多态性与URSA易感性的分层分析分别以年龄、工作属性、吸烟（包括主动和被动）、环境高危因素进行分层分析，结果显示在高龄、重体力劳动、吸烟（包括主动和被动）、接触环境高危因素女性中，G等位基因携带者发生URSA的风险分别增加3.96倍（OR=3.96，95%CI：1.17~12.47）、4.98倍（OR=4.98，95%CI：1.38~15.98）、1.86倍（OR=1.86，95%CI：1.19~2.92）与1.89倍（OR=1.89，95%CI：1.28~2.77）。同样，显性及隐性遗传模型分析中，得到类似的研究结果，见表4。

表4 rs1800796位点SNP与环境相关因素对URSA易感性的分层分析Tab.4 Stratified analysis on association between rs1800796 SNP and environmental risk factors and risk of URSA

2.4 IL-6基因rs1800796位点基因多态性与环境因素的交互作用分析叉生分析显示，吸烟（包括主动和被动）、接触环境高危因素且携带GC+GG基因型女性并未增加URSA的发生风险（OR=1.29，95%CI：0.98~1.69；OR=1.23，95%CI：0.99~2.98），但进一步代入相乘交互作用模型分析显示，吸烟（包括主动和被动）且携带GC+GG基因型女性发生URSA的风险增加1.96倍（OR=1.96，95%CI：1.15~3.35）。接触环境高危因素且携带GC+GG基因型女性 发 生URSA的 风 险 增 加2.18倍（OR=2.18，95%CI：1.29~3.68）。同理，从事重体力劳动且携带GC+GG基因型女性发生URSA的风险增加3.27倍（OR=3.27，95%CI：1.98~5.40），见表5。

表5 rs1800796位点SNP与部分环境因素的交互作用Tab.5 Analysis of interaction between environmental factors and rs1800796 SNP on risk of URSA

3 讨论

URSA病因复杂，其发病机制至今尚未完全明确，是目前生殖健康领域面临的重点与难点问题，严重影响着我国育龄期女性的生殖健康。母胎界面存在独特的细胞因子网络，各因子之间的平衡及免疫调节对维持正常妊娠至关重要。有研究显示，一定程度的炎症反应能促进维持正常妊娠，但过度炎症反应又可导致胚胎着床失败，引起URSA的发生，故母胎界面的免疫失衡在URSA的发生发展过程中发挥了重要作用［7-9］。

人类IL-6基因位于染色体7p15~21区域，由4个内含子和5个外显子组成。IL-6是白介素家族中的一种多肽类促炎细胞因子，是机体复杂细胞因子调节网络中的关键成员，主要在急性炎症反应、免疫反应及C反应蛋白急性期的蛋白调控等方面发挥重要作用，是一类调节Th17/Treg平衡的重要细胞因子［10-11］。有研究表明，URSA患者外周血中IL-6细胞因子水平与健康人群间存在显著性差异，并指出IL-6基因rs1800796位点基因多态性可能增加了URSA的发生风险，但其结论尚不一致［5-6，12-13］。本研究显示，IL-6基因rs1800796位点携带G等位基因的育龄期女性发生URSA的风险增加2.03倍，发生3次以上URSA的风险增加2.15倍。也有研究表明，IL-6基因参与蜕膜调节性T（Treg）细胞中STAT3的磷酸化过程，而STAT3过度磷酸化会损害细胞的增殖，抑制Treg细胞分泌细胞因子，影响母胎免疫耐受及胚胎植入，这可能是发生URSA的病理基础［8］。

环境是人类生存和发展的物质基础，在人类长期的进化过程中，已逐渐对生态环境的变化做出了适应和改造，形成一种动态的过程平衡，而一旦这种平衡被打破将导致URSA等不良妊娠结局的发生［14］。有研究显示，工作或生活环境中接触过量苯、甲苯、甲醛等空气污染物会引起胚胎毒性导致流产［15］；接触环境铅、砷、汞等重金属化合物可干扰正常妊娠的内分泌状态，导致胚胎丢失［16］；接触杀虫剂、化肥、增塑剂等合成化学品后改变体内氧化应激与免疫平衡状态，引发自然流产。本研究显示，G等位基因携带者中，接触环境高危因素的育龄女性发生URSA的风险增加1.89倍；吸烟（包括主动和被动）女性发生URSA的风险增加1.86倍。进一步进行环境-基因交互作用分析显示，接触环境高危因素且携带GC+GG基因型育龄女性发生URSA的风险增加2.18倍；从事重体力劳动且携带GC+GG基因型女性发生URSA的风险增加3.27倍。说明环境高危因素及重体力劳动分别与rs1800796位点基因多态性存在正向协同的交互作用，提示URSA病因复杂，环境与遗传因素在其发生发展过程中均发挥了非常重要的作用。

总之，IL-6基因表达产物在孕早期胚胎植入与胎盘发育过程中发挥了重要作用，其rs1800796位点的基因突变可能会改变母胎界面相关细胞因子的表达水平，破坏调控平衡，造成妊娠丢失［17］，但它们如何影响和调节相关趋化因子的表达，还需要进一步的探究。另外，环境-基因交互作用分析显示，孕早期接触环境高危因素、吸烟（包括主动和被动吸烟）、重体力劳动均与IL-6基因rs1800796位点基因突变存在相乘的交互作用。说明URSA是由环境和遗传因素共同影响的复杂性疾病，在今后的研究中应进一步结合环境因素-内表型-基因进行交互分析，这将有助于从更广泛的角度去阐明URSA的病理机制。