IL-35对慢性阻塞性肺疾病患者Treg/Th17平衡的影响①

赵统秀 李英兰 娄明远 崔晓珊 王佳斌（青海省人民医院全科医学科，西宁 810000）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmo⁃nary disease，COPD）是一种以持续气流受限为特征的肺部疾病，气流受限进行性发展可导致肺源性心脏病和呼吸衰竭。COPD的发病机制尚未阐明，但目前认为与肺部对有毒颗粒或气体慢性炎症反应增强有关［1］。气道、肺实质和肺部血管慢性炎症是COPD的特征性改变，多种免疫细胞（包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、中性粒细胞、单核巨噬细胞等）均参与COPD发病过程［2］。CD4+T细胞在COPD发病中的作用越来越受到重视。初始CD4+T细胞在不同转录因子和细胞因子作用下可分化为不同的辅助性T细胞（T helper，Th）亚群，其中，Treg高表达转录因子FoxP3和CD25，但CD127表达较低，主要参与机体免疫耐受。而Th17高表达转录因子维甲酸相关孤独核受体γt（retinoic acid-related orphan receptorγt，RORγt），并分泌IL-17和IL-22，主要参与机体炎症应答［3］。由于Treg和Th17在功能上相互制约，两者比例变化在感染、免疫及炎症性疾病发展和预后中发挥决定作用［4］。多种因素（包括Toll样受体、Notch信号通路、小分子化合物等）在不同疾病过程中均可影响Treg/Th17平衡［5-8］。IL-35是由EB病毒诱导基因3（epstein-Barr virus-induced gene 3，EBI3）和IL-12 p35亚基构成的异源二聚体，主要由Treg和调节性B细胞分泌，促进Treg增殖分化并抑制Th17功能［9］。但IL-35在COPD过程中对Treg/Th17平衡的调控作用尚未见报道。因此，本研究检测COPD患者IL-35表达及Treg/Th17变化，并采用体外细胞培养系统观察外源性IL-35对COPD患者Treg/Th17平衡的影响。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象选取2020年6月至2020年12月在青海省人民医院全科医学科住院的COPD患者，COPD诊断符合慢性阻塞性肺疾病全球倡议（Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease，GOLD，2017年版）标准［10］，包括慢性咳嗽、咳痰、进行性呼吸困难、暴露于COPD危险因素中的病史，有或没有呼吸窘迫症状；第一秒用力呼气容量（forced expira⁃tory volume in 1 second，FEV1）与用力肺活量（forced vital capacity，FVC）比值<0.7。入选标准：①确诊为COPD并完善肺功能检查；②COPD处于稳定期；③入组前2周内未接受过抗生素、氧疗、糖皮质激素或茶碱类药物治疗；④无急性加重期征象；⑤知情同意。排除标准：①影像学检查合并肺部感染；②合并肺间质纤维化、结核、支气管哮喘或肺部恶性肿瘤；③合并严重心脏疾病、神经系统疾病或肝脏、肾脏功能不全；④妊娠期妇女。所有患者均根据改良医学研究委员会（modified medical research council，mMRC）呼 吸 困 难 评分（1999年版）［11］对COPD患者呼吸困难严重程度进行评分，0分：仅在用力运动时出现呼吸困难；1分：平地快步行走或步行爬小坡时出现气短；2分：由于气短，平地行走时比同龄人慢或需要停下来休息；3分：在平地行走100 m左右或数分钟后需要停下来喘气；4分：因严重呼吸困难不能离开家，或在穿衣服、脱衣服时出现呼吸困难。根据GOLD（2017年版）标准［10］对COPD患者进行严重程度分级，GOLD-1：预计FEV1百分比≥80%；GOLD-2：预计FEV1百分比≥50%且<80%；GOLD-3：预计FEV1百分比≥30%且<50%；GOLD-4：预计FEV1百分比<30%。选择同期在青海省人民医院进行体检的健康志愿者作为对照。本研究经青海省人民医院伦理委员会批准（省医伦理2019013号），所有参与者知情同意，一般资料见表1。

表1 COPD患者和对照者一般资料［例（%）］Tab.1 General characteristics of COPD patients and con⁃trols［n（%）］

1.1.2 试剂与仪器 淋巴细胞分离液（美国Sigma公司）；人CD4+CD25+CD127dim/-Treg分选试剂盒Ⅱ（德国美天旎公司）；重组人IL-35（美国Peprotech公司）；抗人CD4-PE Cy5.5、抗CD25-FITC、抗CD127-PE、抗IL-17-APC（美国BD公司）；人IL-35、IL-10、IL-17、IL-22 ELISA检测试剂盒（武汉华美生物公司）；RNA提取试剂盒（德国Qiagen公司）；Prime⁃Script RT reagent Kit（Perfect Real Time，宝日医生物技术有限公司）；CCK-8试剂盒（武汉碧云天公司）；高速低温离心机（美国西门子公司）；MACS磁力分离架（德国美天旎公司）；M680型全自动酶标仪（美国伯乐公司）；FACS AriaⅡ流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 血浆和外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）分离于清晨空腹采集COPD患者和健康对照者外周血20 ml，EDTA抗凝，4℃、1 000 r/min离心10 min，收集上层血浆，-80℃冻存备用，下层血细胞采用淋巴细胞分离液、以密度梯度离心法分离PBMC，液氮中冻存备用。

1.2.2 CD4+CD25+CD127dim/-Treg纯化采用人CD4+CD25+CD127dim/-Treg分选试剂盒Ⅱ对PBMC中的CD4+CD25+CD127dim/-Treg进行纯化，复苏PBMC后采用台盼蓝检测细胞活性并计数，取1×107个PBMC于4℃、416 r/min离心10 min，采用CD4+CD25+CD127dim/-T细胞生物素标记抗体鸡尾酒Ⅱ剔除CD4-CD127high细胞，收集CD4+CD127dim/-细胞，4℃、416 r/min离心10 min，采用CD25磁珠Ⅱ分选CD25+细胞，得到CD4+CD25+CD127dim/-Treg。

1.2.3 细胞培养取1×106个PBMC加入重组人IL-35（1 ng/ml）刺激培养24 h后收集细胞和上清，取2×104个纯化的CD4+CD25+CD127dim/-Treg采用重组人IL-35（1 ng/ml）刺激培养24 h，洗涤3次去除外源性IL-35，与自体PBMC分别以1∶1、1∶5和1∶10共培养，加入抗CD3/CD28抗体（1μg/ml）共培养48 h。

1.2.4 流式细胞术检测PBMC中CD4+CD25+CD127dim/-Treg和Th17比例取1×105个PBMC，佛波酯（50 ng/ml）和伊乌诺霉素（1μg/ml）刺激培养6 h，同时向培养液中加入莫能霉素（10μg/ml）抑制蛋白转运。刺激后的PBMC转入FACS管，加入抗人CD4-PE Cy5.5、抗CD25-FITC、抗CD127-PE进行表面染色，4℃避光孵育30 min，洗涤，加入破膜固定液，4℃避光孵育30 min，加入抗IL-17-APC进行胞内染色，4℃避光孵育20 min，洗涤2次，加入含4%多聚甲醛的PBS固定后采用FACS AriaⅡ流式细胞仪得到细胞，FlowJo V10软件分析结果。

1.2.5 ELISA检测血浆IL-35和培养上清中IL-10、IL-17和IL-22表达采用商品化ELISA试剂盒按说明书检测血浆IL-35和培养上清中IL-10、IL-17和IL-22水平，设置7点标定的标准本、阳性对照和阴性对照绘制标准曲线，计算各孔相关细胞因子浓度。

1.2.6 RT-PCR检测FoxP3和RORγt mRNA表达采用RNA提取试剂盒提取PBMC中的总RNA，PrimeScript RT reagent Kit两步法试剂盒对RNA中的FoxP3和RORγt mRNA进行半定量分析。反转录及RT-PCR反应体系、反应条件均严格按说明书进行。PCR引 物 序列 为FoxP3 F：5'-CCTCCCCCAT⁃CATATCCTTT-3'，FoxP3 R：5'-TTGGGGTTTGTGTT⁃GAGTGA-3'，RORγt F：5'-AGTCGGAAGGCAAGAT⁃CAGA-3'，RORγt R：5'-CAAGAGAGGTTCTGGGCAAG-3'，GAPDH F：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，GAPDH R：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。以GAPDH为 内 参，2-ΔΔCt法 分 析FoxP3和RORγt mRNA相对表达。

1.2.7 CCK-8检测细胞增殖细胞培养的最后4 h向培养液中加入10%CCK-8溶液，培养结束后测量490 nm处OD值，以OD490表示细胞增殖水平。

1.3 统计学处理采用SPSS21.0软件进行统计学分析，对计量资料进行正态性检测，所有计量资料均符合正态分布，采用±s表示，两组间比较采用t检验或配对t检验，多组间比较进行单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 COPD患者血浆IL-35水平COPD组与对照组血浆IL-35水平差异有统计学意义［（108.20±12.13）pg/mlvs（133.30±22.91）pg/ml，t=5.980，P<0.000 1，图1A］，但<70岁和≥70岁COPD患者血浆IL-35水平差异无统计学意义［（106.00±12.27）pg/mlvs（109.90±11.97）pg/ml，t=1.063，P=0.294 0，图1B］，吸烟和不吸烟COPD患者差异亦无统计学意义［（107.30±11.29）pg/mlvs（110.30±14.18）pg/ml，t=0.756，P=0.454 0，图1C］。mMRC评分为4分的COPD患者血浆IL-35水平显著低于2分、3分患者［（100.90±12.08）pg/mlvs（115.30±10.03）pg/ml，（111.40±9.78）pg/ml，t=3.066，t=2.851，P=0.005 3，P=0.007 5，图1D］。GOLD分级4级的COPD患者血浆IL-35水平显著低于2级、3级患者［（100.80±12.71）pg/mlvs（114.50±9.81）pg/ml，（111.20±9.67）pg/ml，t=2.912，t=2.714，P=0.007 6，P=0.011 0，图1E］。

图1 COPD组和对照组血浆IL-35水平比较Fig.1 Comparison of plasma IL-35 level in COPD group and control group

2.2 COPD患者Treg/Th17变化采用前向散射光（forward scatter，FSC）和侧向散射光（side scatter，SSC）对淋巴细胞进行圈门，在淋巴细胞门内，对CD4+T细胞进行圈门，在CD4+T细胞门内对CD25+CD127dim/-细胞圈门，即为CD4+CD25+CD127dim/-Treg，在CD4+T细胞门内对IL-17+细胞圈门，即为Th17（图2A）。COPD组外周血CD4+CD25+CD127dim/-Treg占CD4+T细胞的比例显著低于对照组［（4.71±1.00）%vs（6.07±1.03）%，t=5.362，P<0.000 1，图2B］，COPD组外周血Th17占CD4+T细胞的比例显著高于对照组［（2.97±0.72）%vs（2.28±0.61）%，t=4.060，P=0.000 1，图2C］，COPD组Treg/Th17显著低于对照组（1.69±0.60vs2.86±0.91，t=6.279，P<0.000 1，图2D）。

图2 COPD组和对照组外周血CD4+CD25+CD127dim/-Treg、Th17、Treg/Th17比较Fig.2 Comparison of peripheral CD4+CD25+CD127dim/-Treg，Th17 and Treg/Th17 between COPD group and control group

2.3 重组IL-35对COPD患者PBMC中Treg/Th17、转录因子表达和细胞因子分泌的影响重组人IL-35刺激后CD4+CD25+CD127dim/-Treg占CD4+T细胞比例显 著 升 高［（5.31±1.25）%vs（4.71±1.00）%，t=4.157，P=0.000 2，图3A］，而Th17占CD4+T细胞比例在无IL-35刺激和经IL-35刺激后差异无统计学意义［（2.97±0.72）%vs（2.85±0.68）%，t=0.867，P=0.391 0，图3B］，Treg/Th17显著升高（2.00±0.79vs1.69±0.60，t=2.547，P=0.015 0，图3C），培养上清中IL-10水平显著升高［（145.10±24.40）pg/mlvs（123.50±24.11）pg/ml，t=4.520，P<0.000 1，图3D］，而IL-17水平［（273.40±72.28）pg/mlvs（286.40±65.35）pg/ml，t=0.837，P=0.407 0，图3E）和IL-22水平在无IL-35刺激和经IL-35刺激后差异无统计学意义［（7.76±1.36）ng/mlvs（8.11±1.35）ng/ml，t=1.128，P=0.266 0，图3F］，FoxP3 mRNA表达显著升高（1.27±0.19vs0.96±0.10，t=7.600，P<0.000 1，图3G），而RORγt mRNA表达在无IL-35刺激和经IL-35刺激后差异无统计学意义（1.06±0.12vs1.05±0.12，t=0.768，P=0.447 0，图3H）。

图3 重组IL-35对COPD患者PBMC中Treg/Th17、细胞因子分泌和转录因子表达的影响Fig.3 Influence of recombinant IL-35 on Treg/Th17，cy⁃tokine secretion，and transcription factor expres⁃sion in PBMC from COPD patients

2.4 重组IL-35对COPD患者Treg免疫抑制活性的影响取14例COPD患者PBMC，分选CD4+CD25+CD127dim/-Treg，经IL-35刺激后与自体PBMC分别以1∶1、1∶5和1∶10共培养48 h，重组IL-35刺激Treg后，Treg抑制PBMC增殖的能力显著增强（图4）。

图4 重组人IL-35对COPD患者CD4+CD25+CD127dim/-Treg免疫抑制功能的影响Fig.4 Influence of recombinant IL-35 on immunosuppres⁃sive function of CD4+CD25+CD127dim/-Treg in COPD patients

3 讨论

IL-35是一种新发现的抗炎症因子，但IL-35在不同炎症性疾病中的表达存在差异。在脓毒症诱导的系统性炎症、睡眠呼吸暂停综合征、川崎病等炎症性疾病中，外周血IL-35水平均升高［12-14］。但在Vogt-小柳原田综合征、干燥综合征等自身免疫性疾病中，IL-35水平降低［15-16］。COPD是一种慢性炎症性疾病，既往研究发现，COPD患者外周血IL-35水平显著降低，且与患者年龄、吸烟史、疾病分期分级等密切相关［17-18］。本研究发现，COPD患者IL-35水平降低，但与患者年龄、吸烟史等无关，本研究以70岁作为分界点进行统计分析，由于病例数较少，可能会导致患者年龄、吸烟史相关性判断产生统计偏倚。但IL-35与疾病分级呈负相关，提示IL-35参与了COPD进程，但IL-35在COPD过程中发挥何种作用尚未阐明。

Treg和Th17失衡在自身免疫性疾病和炎症性疾病中均发挥重要作用［3］。Treg和Th17共享TGF-β信号通路，在TGF-β单独作用下，初始CD4+T细胞分化为Treg；而在IL-6或IL-21联合TGF-β共同作用下，初始CD4+T细胞分化为Th17［3-4］。Treg分泌IL-10和IL-35等抑制性细胞因子，主要发挥免疫抑制作用，抑制自身免疫应答；而Th17分泌IL-17和IL-22，募集中性粒细胞等非特异性炎症细胞，促进感染和炎症过程，在多种自身免疫性疾病中发挥促炎作用［3］。因此，两类细胞在炎症和免疫应答中作用完全相反。在斑块状银屑病患者皮损部位Treg/Th17下降，FoxP3水平降低，RORγt水平升高［19］。新型冠状病毒感染患者中，Treg/Th17、FoxP3/RORγt、IL-10/IL-17均 显 著 降 低［20］。本 研 究 发 现，COPD患 者CD4+CD25+CD127dim/-Treg比例降低，Th17比例升高，Treg/Th17降低，与既往在COPD小鼠模型中的研究结果一致［21-22］。提示COPD患者Treg水平降低，免疫抑制功能下降，而Th17水平升高，诱导炎症应答，说明Treg/Th17失衡在COPD发病中发挥重要作用。

IL-35在结缔组织病、手足口病、牙周炎中均可调控Treg/Th17平衡，参与疾病发病过程［23-25］。IL-35不但可增强Treg的免疫抑制功能，在过敏性鼻炎中还可抑制Th17应答［26-27］。但本研究发现，外源性IL-35刺激COPD患者PBMC后，CD4+CD25+CD127dim/-Treg比例和FoxP3 mRNA水平升高，IL-10分泌增多，但Th17比例、RORγt mRNA水平、IL-17/IL-22水平均无明显变化，导致Treg/Th17升高，更为重要的是，IL-35刺激后Treg的免疫抑制功能增强，提示IL-35主要影响COPD患者Treg水平和功能，但对Th17数量和功能无明显影响。

本研究具有一定局限性，首先，本研究对照组病例数偏少。其次，由于吸烟是COPD发病的重要危险因素之一，导致在有吸烟史和无吸烟史COPD患者血浆IL-35比例中，无吸烟史例数偏少。因此，本研究结果仍需要扩大样本量并进行动物实验加以证实。

综上，COPD患者IL-35水平降低无法维持CD4+CD25+CD127dim/-Treg水平和免疫抑制功能，导致Treg/Th17数量和功能失衡。COPD疾病过程中IL-35可能主要发挥免疫保护作用，IL-35可作为COPD治疗的潜在靶点之一通过调控机体免疫应答平衡发挥治疗作用。