金纳米棒调控碳量子点荧光探针的构建与分析

陆筑凤，王红梅，李加友，程若冰，刘 露

（嘉兴学院a.分析测试中心；b.生物与化学工程学院，浙江嘉兴 314001）

0 引言

碳量子点（Carbon Quantum Dots，CQDs）与传统的半导体量子点相比，具有独特的发光性能、良好的生物相容性、低毒性、低成本、易合成等优点，广泛用于各类物质的荧光分析检测［1-3］。CQDs 作为荧光探针检测虽然灵敏度高，如王坤杰等［1］证实了CQDs 对汞离子检测水平为10 nmol／L、2 ppb，检出限为3.4 nmol／L，但CQDs 存在选择性差的问题、在检测过程中易受其他物质的干扰。因此，如何提高CQDs 的选择性是当前研究的热点和难点。目前，通过改进合成方法获得选择性掺杂特定元素的CQDs，可以加强结合特性、实现荧光行为可控的途径较为多用，如以荧光内滤效应为基础，用氮或锰掺杂的CQDs 测定食品中的盐酸四环素［4］和双酚A［5］；用铁掺杂的CQDs 分别检测了抗坏血酸［6］、H2O2和多巴胺［7］，提高了CQDs的选择性。

掺杂有金属元素的CQDs不可避免的会引起生物安全性考虑，本文提出采用金纳米棒调控CQDs 荧光发射行为的这一新视角，拓宽了CQDs 选择性研究的思路和方法。金纳米棒（gold nanorods，GNRs）具有易于操控、便于修饰、高效选择性和生物相容性等优点，能够与光产生独特的相互作用，其吸光系数高，大多在520 nm处有较强紫外吸收［8］，吸收光谱与CQDs 的发射光谱有效重叠而引发荧光内滤效应或荧光共振能量转移［8-9］，可以实现GNRs对CQDs荧光发射行为的调控，有效提高CQDs荧光探针的选择性。

鉴于上述原因，本文采用一步水热法和晶种子生长法合成CQDs 与GNRs 材料，分析表征材料微观形貌、结构组成，研究该荧光体和吸光体的性能，优化应用条件，确立CQDs荧光信号的关闭与开启技术方法，以构建一种基于GNRs对CQDs荧光调控为依托的新型荧光探针。

1 实验方法

1.1 调控型荧光探针的工作原理

从GNRs 调控CQDs 的荧光信号“开-关”思路出发，以GNRs对CQDs 产生荧光作用引发荧光变化作为检测信号，稳定分散的GNRs 的紫外吸收会使得CQDs的荧光减弱或猝灭，即信号“关”。无保护的GNRs在高盐溶液中会聚集，对CQDs 的荧光猝灭降低，CQDs的荧光恢复，信号“开”［10-11］，构建荧光信号受调控的荧光探针，如图1 所示。

图1 金纳米棒调控碳量子点荧光信号原理示意图

1.2 主要试剂及仪器

（1）实验材料与试剂。氯金酸（HAuCl4）、浓硝酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、柠檬酸三铵、柠檬酸，分析纯，阿拉丁；抗坏血酸（Vc），分析纯，天津市大茂化学试剂厂；乳糖，分析纯，上海化学试剂总厂；氯化钠，分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司；磷酸氢二钠，分析纯，西陇科学股份有限公司；浓盐酸，分析纯，浙江中星化工试剂有限公司；透析袋，截留分子量1 000 D 和3 500 D，北京索莱宝科技有限公司；实验用水，4.5 L娃哈哈饮用纯净水。

（2）仪器设备。紫外-可见分光光度计，岛津；F-7000 分子荧光光度计、S-4800 场发射扫描电镜，日立；Talos F200X 场发射透射电镜，赛默飞；DXRxi 拉曼光谱，赛默飞世尔。

1.3 材料制备

（1）碳量子点的制备。称取0.360 3 g 乳糖和6.080 5 g柠檬酸铵，溶于30 mL的纯水中，180 ℃恒温水热反应4 h，冷却，超声，9 000 r／min高速离心多次，收集上清液。置于透析袋中遮光透析48 h，制得CQDs溶液。

（2）金纳米棒的制备。制备金种子液［12］：取0.2 mol／L CTAB 溶液5 mL 放入烧杯中搅拌，滴加0.5 mmol／L HAuCl4溶液5 mL，待其在溶液中均匀分散后，快速加入新鲜配制的0.01 mol／L NaBH4溶液0.6 mL，溶液由浅黄色变为棕黄色，继续搅拌2 min，于25℃静置2 h备用。GNRs生长：圆底烧瓶中加入一定量的0.2 mol／L CTAB溶液，滴加8 mmol／L HAuCl4溶液4 mL，稳定后加入0.078 8 mol／L Vc 溶液1 mL，添加纯水至总体积50 mL，体系中加入100 μL金种子液反应12 h。取出紫红色上清液，收集棕色沉淀，7 000 r／min离心洗涤制得金纳米棒。

1.4 材料表征

本文进行材料表征的方法：①用高分辨透射电镜（HRTEM）表征材料微观形貌：在镀有超薄碳膜的铜网捞取微量碳量子点溶液，自然干燥，分辨率5 nm；②用扫描电镜分析（SEM）微观形貌：将试样溶液滴度到单晶硅片上，置于电镜预交换室静置24 h，加速电压选择1.0 kV，Ie选择15 μA，观察材料的均匀性；③用傅里叶红外（FTIR）分析材料的官能团组成：取微量冷冻干燥的试样与KBr在红外灯照射下研细混匀，置于压片机中15 兆帕压成透明薄片，分辨率为4 cm-1，扫描范围为400～4 000 cm-1；④用X 射线衍射粉末衍射（XRD）定性分析物质、确定晶格常数：采用铜靶射线（λ ＝1.541 8 Å），CQDs 溶液冷冻干燥成绿色粉末、GNRs溶液滴度烘干，扫描速度为6 °／min，测试电压为30 kV，电流20 mA，5°～80°扫描；⑤用拉曼光谱测试CQDs的特征结构和晶格缺陷：将溶液滴度于载玻片上，以532 nm激发直接观察。

1.5 CQDs的量子产率测定

通过测量CQDs水溶液的紫外可见吸收光谱及荧光光谱（λex＝335 nm）。将荧光发射峰的积分面积F及相应的吸收值A（λem＝440 nm）代入下式计算得到量子产率［13］：

式中：x表示测试样品；s表示标准物质；Φ为荧光量子效率；A为激发波长下的吸收值；F为荧光发射峰的积分面积；n表示溶剂的折光率，水为1.333，乙醇为1.366。实验中采用的标准物为罗丹明B（乙醇溶液，荧光量子效率为90%）。

2 实验结果与分析

2.1 CQDs的微观形貌和结构分析

图2 为CQDs 的形貌和结构特征。由图2（a）的HRTEM表征CQDs的微观形貌可知，制备的CQDs 粒子大小均匀，成圆形或椭圆形球体，平均粒径6 nm，有明显得晶格条纹约为0.21 nm。由图2（b）的CQDs冻干粉的衍射结果可知，2θ 在25 °时有显著石墨（002）面特征峰，表面CQDs 是典型的碳纳米材料。由图2（c）的Raman光谱图可知，材料在1 580、1 365 cm-1有2个明显峰，其中1 580 cm-1处称为G峰，代表具有石墨特征结构，而1 365 cm-1处称为D峰，与石墨晶格缺陷或晶格对称结构破坏相关，代表一种无序结构峰。2峰积分强度比ID／IG通常表示材料的石墨化程度，值越小说明石墨特征结构越明显，石墨化程度越高［14］。经计算，CQDs的ID／IG＝0.72，表明CQDs是一种典型的石墨化结构的量子点。

由图2（d）的CQDs 红外光谱图可知，在3 300 cm-1附近出现宽而强的吸收峰是—OH 和—NH2振动形成的吸收峰，在2 960 cm-1处是—CH 的伸缩振动峰，1 624 cm-1为CONH中和—NH的振动峰，1 218 cm-1是C—N的伸缩振动峰，1 083 cm-1为C—O的弯曲振动峰［15］。由此分析CQDs表面存在—OH、、—NH等亲水性基团，具有良好的水溶性。

图2 CQDs形貌和结构表征

2.2 碳量子点的荧光性能

图3 为CQDs的光学性能表征，紫外-可见吸收光谱被用作监测CQDs合成的工具。由图3（a）的CQDs紫外吸收光谱图可知，CQDs的特征吸收峰出现在240和330 nm处，分别为CQDs的π→π*和n→π*跃迁吸收峰；由图3（b）的荧光光谱可知，CQDs 溶液在335 nm处有较强紫外特征吸收峰，与UV 结果一致，该峰是由骨架组成的共轭双键中的p-p*跃迁吸收所致，峰型较为光滑。用335 nm 激发CQDs 可在440 nm处有显著荧光发射峰，确定335 nm 为CQDs 的激发波长，440 nm 为荧光发射波长。CQDs 具有荧光不依赖激发的独特荧光性，荧光性能稳定，CQDs 的荧光量子产率为17.6%。

图3 CQDs光学性能

2.3 金纳米棒的形貌结构与光学性能

图4 所示为扫描电镜表征短棒、中棒、长棒3 种不同长径比的GNRs的形貌、尺寸大小以及长棒形GNRs（R＝15）的透射电镜表征和晶格计算。

图4 短棒（a）、中棒（b）、长棒（c）形GNRs的SEM和TEM（d）图

（1）短棒形GNRs 的SEM 表征。晶种生长法可以制备相对纯净的GNRs，但长径比小的短棒，如图4（a）所示，长127 nm、宽16 nm，其制备过程中，还会有大量小颗粒生成，多次离心可以提纯但会导致GNRs堆积。

（2）中棒形GNRs的SEM表征。调整CTAB浓度可以使GNRs 更长，在未实现两端定向生长前，GNRs变长的同时也会横向变宽，如图4（b）所示，GNRs长度延长至200 nm，宽度也增加至28 nm，长径比基本无变化，金纳米块状型大颗粒（六边形、梯形状）增多，影响GNRs纯度。

（3）长棒形GNRs 的SEM 表征。优化条件控制两端生长可以增大长径比，获得宽度不变，更长的GNRs，如图4（c）所示，长240 nm，宽16 nm，R＝15，均匀且纯度高，对CQDs的荧光调控也最稳定。

（4）长棒形GNRs 的TEM 表征。图4（d）为GNRs（R＝15）的HRTEM 图，纳米棒的晶面间距分别为0.238 1、0.205 3 nm，分别对应金纳米棒的（111）面和（200）面。

（5）长棒形GNRs的XRD 分析。采用XRD分析晶体结构，结果如图5 所示。图5 中4 个衍射峰在2θ ＝38.1°、44.4°、64.5°和77.5°处，分别对应面心立方结构金纳米棒的（111）、（200）、（220）和（311）晶面（JCPDS No.89-3697），与TEM结果一致。因此，将长240 nm，宽16 nm，R＝15 的GNRs 用于调控CQDs 的荧光性能。

图5 长棒形GNRs（R ＝15）的XRD图

（6）3 种GNRs 的紫外吸收性能。图6 为3 种不同长径比GNRs 的紫外吸收光谱图，短棒形GNRs 在520 nm处有平缓的吸收峰，中长形和长棒形GNRs 均在508 nm处有较强的宽吸收峰，GNRs的吸收光谱与CQDs的发射光谱存在一定重叠，这可能即是实现GNRs对CQDs荧光发射行为的调节的原因，该调节能有效提高CQDs荧光探针的选择性。

图6 三种长径比GNRs的UV谱比较

2.4 金纳米棒对碳量子点的荧光调控

快速响应、高灵敏性、高可靠性是成为荧光探针的前提，GNRs对CQDs荧光信号调控的主要影响因素有体系pH、反应时间、浓度、荧光猝灭和恢复程度，图7为影响因素的优化结果。

（1）pH影响。在室温25 ℃时，CQDs溶液pH对其荧光发射的强度有较大影响，由图7（a）可知，不同pH溶液体系中，CQDs 的荧光强度不同，在pH 6.5 的磷酸缓冲溶液中，荧光发射强度最大，因此，本反应体系选择室温25 ℃，pH 6.5 的磷酸缓冲溶液。

（2）反应时间。加入GNRs后，CQDs溶液的荧光强度随即有不同程度的下降，表明发生了荧光猝灭反应，由图7（b）可知，检测荧光强度随时间的变化，猝灭反应在30 min内达到最大程度，因此，GNRs 对CQDs荧光信号关闭的调控是快速的，30 min即可稳定。

图7 GNRs 调控条件优化

（3）GNRs用量。取适量GNRs（R＝15、OD 0.28）加入到一定量的CQDs（OD 0.21）溶液中，GNRs 的添加量对CQDs的荧光猝灭程度有很大影响，由图7（c）可知，随着GNRs 添加量的增多，猝灭程度越大，当体系中，CQDs与GNRs的溶液体积比为1∶12 时，达到最大程度猝灭，荧光信号调控存在最佳浓度比例关系。

（4）荧光信号恢复。以CQDs 和GNRs 溶液体积比1∶1的调控反应为基础试验，发现GNRs对CQDs产生荧光猝灭，导致荧光信号强度降低，由图7（d）可知，若在反应体系中添加适量的氯化钠溶液，CQDs 的荧光信号随即恢复到初始值，意味着被关闭的荧光信号重新开启，荧光猝灭只是信号的“关”环节，信号的重新开启也是调控的重要内容，这可能是由于GNRs 受盐诱导而聚集导致其失去对CQDs的荧光影响。由此表明，GNRs可以调控CQDs 的荧光信号，构建复合调控型荧光探针。

3 结语

本文研究的新型纳米荧光探针的合成与构建实验，通过乳糖和柠檬酸铵为原料一步水热反应合成了荧光性能良好的碳量子点，量子产率17.6%、最大激发和发射波长分别为335 和440 nm；以晶种子生长法合成了不同长径比的金纳米棒，用于调控碳量子点的荧光发射，其中，R＝15 的金纳米棒在508 nm 处有较强的宽吸收峰，对碳量子点的荧光发射有显著吸收达到荧光猝灭，调节体系盐浓度可恢复碳量子点的荧光信号，成功地建立了一种新型荧光探针。

实验验证了以金纳米棒调控碳量子点荧光信号为理论基础构建荧光探针用于分子检测思路的可行性和正确性。该复合探针有望与核酸适配体共同构建探针从而提高适配体传感器的实用性能。本文的实验内容也运用于实验教学中，开拓了学生视野，培养创新意识。