1-磷酸鞘氨醇、1-磷酸鞘氨醇受体2在急性主动脉夹层患者外周血中的表达及其与预后的关系

王期峰，路 霖

（青海省心脑血管病专科医院心外科，西宁 810000）

急性主动脉夹层（acute aortic dissection，AAD）是临床较为常见的心血管急危重症，其起病急、病情凶险、进展快、预后差，严重威胁患者生命安全［1］。目前，AAD 发病机制尚未完全解释清楚，但学者认为其发病与外伤、免疫调节、原发性高血压（高血压）、动脉粥样硬化、血管发生、血管炎症反应等密切相关［2-3］。有关报道显示，1-磷酸鞘氨醇（sphingosine 1-phosphate，S1P）是一种具有多效性的脂质分子，其可能在动脉粥样硬化发病过程中起重要作用，S1P 可能是减轻动脉粥样硬化疾病的新靶标［4］。另外，1-磷酸鞘氨醇受体2（sphingo⁃sine-1-phosphate receptor 2，S1PR2）属于G 蛋白耦联受体家族成员之一，其在冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）患者血清中表达失调，S1PR2 通过微小RNA-126 负调控，进而在冠状动脉粥样硬化进展中发挥重要作用［5］。但S1P、S1PR2 在AAD中的表达及其与预后的关系尚未发现有关报道，基于此，本研究通过检测AAD 患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中S1P、S1PR2 表达，分析其与预后的相关性，以期为临床诊断、评估AAD患者预后提供一定参考价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015 年1 月至2018 年1 月青海省心脑血管病专科医院收治的AAD 患者85 例进行研究，称AAD组，其中男57例，女28例；年龄（47.85±6.97）岁。并选取同时间段内本院体检健康者85 名进行对照研究，称对照组，其中男53 例，女32 例；年龄为（48.32±7.89）岁。两组性别比例、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

诊断标准：参考《2014 年欧洲心脏病学会主动脉疾病诊治指南解读》相关AAD 判定标准进行诊断［6］。纳入标准：（1）患者均符合AAD 有关诊断标准，均结合患者临床体征、症状、磁共振成像等影像学确诊；（2）入院前无视听障碍、无精神系统疾病，意识清楚，无沟通障碍者；（3）患者病理检查资料齐全、可靠；（4）无严重脏器、肢体缺血症状者。排除标准：（1）合并急、慢性感染或炎症性风湿病、自身免疫性疾病的患者；（2）入院前3 个月内服用免疫抑制剂、非甾体抗炎药的患者；（3）合并结缔组织疾病、恶性肿瘤的患者；（4）合并肝及肾功能不全的患者；（5）近半年内行外科手术、创伤者。

患者预后情况：本组85 例AAD 患者均进行深低温停循环+单侧或双侧脑灌注技术的手术治疗，2 d 内共死亡29 例，存活56 例，存活定义为预后良好，死亡定义为预后不良。

所有患者及其家属对本研究均知情同意，并签署知情同意书，本研究符合《赫尔辛基宣言》，报经本院伦理委员会审核、批准后实施。

1.2 主要试剂与仪器

Ficoll 淋巴细胞分离液（货号：P8900）购买于上海恒斐生物科技有限公司；Trizol Reagent（货号：15596-026）购买于上海联硕生物科技有限公司，PrimeScript RT Master Mix（货号：RR036A）购买于广州威佳科技有限公司，SYBR Green PCR Mas⁃ter Mix（货号：YDM6206）购买于上海羽朵生物科技有限公司。

紫外分光光度计（型号：DU-730）购买于上海普迪生物技术有限公司，qRT-PCR 仪（型号：LightCycler®480II）购自罗氏诊断产品（上海）有限公司。

1.3 样本收集

收集所有受试者于晨起空腹状态下外周静脉血4 mL，置于含有肝素抗凝管中，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离各样本PBMC，于-80℃冰箱中保存，用于检测S1P、S1PR2、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）表达。

1.4 qRT-PCR法检测PBMC中S1P、S1PR2、MMP-9表达

于-20 ℃冰箱中取出PBMC 样本，冰上溶解，依照TRIzol 试剂盒说明书添加TRIzol 裂解液，从PBMC 样本中提取总RNA。采用紫外分光光度计测定抽提RNA 样本在260 nm、280 nm 波长处的吸光度（Absorbance，A），并以抽提RNA 样本A260/A280比值在1.8～2.1 之间为合格检测样本，继续下一步操作。以2 μL 总RNA 为模板，按照PrimeScript RT Master Mix 说明书进行反转录，得cDNA。参考SYBR Green PCR Master Mix 说明书配制扩增反应体系，将cDNA 扩增、检测。S1P、S1PR2、MMP-9 及内参GAPDH 引物序列见表1。以2-ΔΔCT法计算S1P、S1PR2、MMP-9 相对表达。

表1 S1P、S1PR2、MMP⁃9 及内参GAPDH 的引物序列

1.5 统计学分析

本组所得实验数据均利用SPSS 25.0 软件进行统计学分析。经正态性检验，计量数据均符合正态分布，以（）的形式表示，组间数据比较，进行独立样本t检验。计数资料以［n（%）］表示，组间数据比较，采用卡方（χ2）检验。以Pearson 相关性分析法分析AAD 患者PBMC 中S1P、S1PR2 表达与MMP-9 的相关性。以Logistic 回归分析法分析AAD 预后的影响因素：以AAD 预后是否良好（预后良好=0，预后不良=1）为因变量，以冠心病（否=0，是=1）、S1P（连续变量）、S1PR2（连续变量）、MMP-9（连续变量）为自变量。采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）评估PBMC 中S1P、S1PR2、MMP-9 表达对AAD 患者预后的的诊断效能。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受试者PBMC 中S1P、S1PR2、MMP-9 表达比较

与对照组相比，AAD 组患者PBMC 中S1P 表达明显降低，S1PR2、MMP-9 表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表2。

表2 两组受试者PBMC中S1P、S1PR2、MMP-9表达比较 ［n=85，±s］

表2 两组受试者PBMC中S1P、S1PR2、MMP-9表达比较 ［n=85，±s］

2.2 AAD 患者PBMC 中S1P、S1PR2 表达与MMP-9的相关性

Pearson 相关性分析结果显示，AAD 患者PBMC中S1P 表达与MMP-9 均呈负相关（r=-0.477，P＜0.05），S1PR2 表达与MMP-9 呈正相关（r=0.487，P＜0.05），详见图1、2。

图1 AAD 患者PBMC 中S1P 表达与MMP-9 的相关性散点图

图2 AAD 患者PBMC 中S1PR2 表达与MMP⁃9 的相关性散点图

2.3 两组不同预后AAD 患者临床资料及PBMC中S1P、S1PR2、MMP-9 表达比较

与存活组相比，死亡组AAD 患者冠心病比例、S1PR2、MMP-9 表达均显著升高，S1P 表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表3。

表3 两组不同预后AAD 患者临床资料及PBMC 中S1P、S1PR2、MMP-9 表达比较 ［n（%），±s］

表3 两组不同预后AAD 患者临床资料及PBMC 中S1P、S1PR2、MMP-9 表达比较 ［n（%），±s］

2.4 Logistic 回归分析分析主动脉夹层患者预后的影响因素

以AAD 预后是否良好为因变量，以冠心病、S1P、S1PR2、MMP-9 表达为自变量，行Logistic 回归分析，结果显示，S1PR2、MMP-9 为AAD 预后的危险因素（均P＜0.05），S1P 为AAD 预后的保护因素（P＜0.05），详见表4。

表4 影响AAD 患者预后的Logistic 回归分析

2.5 PBMC 中S1P、S1PR2、MMP-9 表达对AAD 患者预后的评估价值

ROC 分析结果显示，PBMC 中的S1P、S1PR2表达预测AAD 不良预后的曲线下面积（area undercurve，AUC）分别为0.866、0.875，两者诊断价值高于MMP-9，血清S1P、S1PR2 联合预测AAD 不良预后的AUC（0.927），其灵敏度、特异度分别为90.6%、83.5%，详见表5、图3。

表5 各项指标对AAD 不良预后的诊断效能

图3 PBMC 中S1P、S1PR2、MMP-9 表达对AAD 患者预后的ROC 图

3 讨论

AAD 主要是由主动脉破裂引起的心血管疾病，以主动脉中层弹力纤维变性断裂、平滑肌坏死为病理基础，以急性胸痛为主要临床症状，可导致死亡［7-8］。目前，临床多采用影像学诊断AAD，但影像学诊断费用较高，且搬动患者过程中易使动脉瘤破裂，造成严重后果。因此，寻找可有效诊断AAD、评估患者预后的生物标志物，对改善AAD患者生存质量有一定积极意义。

S1P 是一种膜磷脂类代谢产物，可通过与细胞表面的S1PR2 等受体作用，进而参与免疫调节、心肌缺血再灌注损伤、血管舒张、血管生成及内皮保护等生物学过程［9-10］。近期研究显示，S1P 通过与特异性G 蛋白偶联受体结合介导心脏炎症等反应，其可能是治疗缺血再灌注损伤及冠心病的潜在靶标［11］。此外，Kitano 等［12］研究认为S1P 可调节血管平滑肌细胞增殖及迁移，进而引起血管重建，造成动脉粥样硬化和再狭窄，且S1P 信号通路在血管损伤后的新内膜增生中起重要作用。以上研究表明，S1P 表达异常可能与血管异常疾病关系密切。本研究中AAD 组患者PBMC 中S1P 表达明显低于对照组，提示S1P 可能在AAD 病理进展中具有重要作用，推测低水平S1P 可能通过与其受体相结合，进而调节血管炎症反应、血管新生，从而促进AAD 发展。S1PR2 在调节血管舒张度、血管通透性等方面起重要作用，S1PR2 可通过影响血管平滑肌细胞迁移功能、血管内皮细胞屏障通透性及血管发生、发育等过程，进而影响血管稳态，促进炎症反应，从而影响心血管系统疾病进程［13］。既往研究认为，S1PR2 在动脉粥样硬化内皮病变中浓度显著升高，其可通过影响信号传导进而影响内皮炎症反应，从而在心血管疾病发生、发展中发挥重要作用［14］。本研究中AAD 组患者PBMC 中S1PR2 表达明显高于对照组，提示S1PR2表达异常可能与AAD 病变过程有关，究其原因，高浓度S1PR2 可能通过影响血管稳态，促进血管炎症反应，从而在AAD 发展中发挥促进作用。

MMP-9 是造成主动脉中层弹力纤维变性、平滑肌坏死的重要酶类之一，其在AAD 患者血清中浓度显著上升，具有诊断AAD、评估患者预后的潜在价值［15］。本研究中AAD 患者PBMC 中MMP-9表达显著上调，与孟少志等［15］研究一致，提示MMP-9 可能在AAD 疾病进展中起重要作用，推测高浓度MMP-9 可引起主动脉弹力蛋白及胶原纤维降解，导致血管壁薄弱，进而造成主动脉持续扩张至破裂，促进AAD 病情发展。本研究显示，AAD 患者PBMC 中S1P 表达与MMP-9 均呈负相关，S1PR2 表达与MMP-9 呈正相关，提示S1P、S1PR2 可能与MMP-9 相互作用，进而影响AAD 发展，但具体作用机制有待深入探究。

本研究中死亡组AAD 患者冠心病比例、S1PR2、MMP-9 表达均显著高于存活组，S1P 表达明显低于存活组，提示冠心病、S1P、S1PR2、MMP-9 均可能影响AAD 患者预后情况。进一步研究显示，S1PR2、MMP-9 为AAD 预后的危险因素，S1P为AAD 预后的保护因素，提示PBMC 中S1P 表达浓度、S1PR2、MMP-9 浓度升高均可能会增加AAD患者发生不良预后的风险，早期监控S1P、S1PR2、MMP-9 浓度，有利于改善AAD 患者预后情况。研究发现，PBMC 中S1P、S1PR2 浓度预测AAD 不良预后的AUC 分别为0.866、0.875，当S1P 相对表达量＜0.54 或S1PR2＞1.97 时，AAD 患者发生不良预后的风险较高，提示S1P、S1PR2对AAD不良预后有一定的评估价值，且两者诊断价值高于MMP-9；S1P、S1PR2 联合预测AAD 不良预后的AUC 为0.927，其灵敏度90.6%，特异度为83.5%，提示S1P、S1PR2联合诊断AAD 不良预后的灵敏度高于单独诊断，两者联合可提高AAD 不良预后的预测价值。

综上所述，AAD 患者S1P 表达降低，S1PR2 表达升高，两者可能与AAD 发病过程相关，两者联合可有效提高对AAD 不良预后的预测价值，可更好地评估AAD 患者预后情况。但本研究未深入探讨S1P、S1PR2 在AAD 发病中的机制，后期将增加样本量进行研究。