痛泻要方拆方对腹泻型肠易激综合征大鼠脑肠肽的影响研究

王科凯，杨焱麟，周彦妮，肖瑾，谢欣，吴芹萍，陈敏

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是世界范围内常见的肠脑互动紊乱的疾病之一，据估计全球约有10%的人受到影响［1］，其中我国以腹泻型肠易激综合征（IBS-D）多见［2］。临床上IBS以腹部不适、排便习惯不良或大便异常为主要特征［3］，其病程迁延，容易反复发作，严重影响患者身心健康［4］。IBS发病机制尚未完全明确，但内脏高敏是公认的病理生理基础［4-5］，内脏高敏的发生是一个复杂的病理过程，其作用机制亦未完全明确，脑肠肽（brain-gut peptide）异常表达与内脏高敏密切相关［6］，其中P物质（substance P，SP）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）作为相关神经肽参与了IBS-D的发展过程，对肠神经系统具有调节作用［7-8］。关于IBS-D的治疗目前指南推荐采用止泻药、解痉药、益生菌、精神药物治疗等方式［9］，但多数患者使用指南推荐的一线药物后症状仍难以改善［10］，转而寻求中医药治疗。既往研究表明痛泻要方可以通过调节脑-肠轴［11-13］、内脏高敏［14-15］、肠道通透性［16］、BDNF 表达［17］，改善IBS-D患者腹痛和腹泻症状。

前期研究发现，痛泻要方可调节大鼠海马及结肠组织中的BDNF mRNA表达，呈现双向调节脑肠轴的作用［17］。中医认为肝郁脾虚是IBS-D基本病机，常用痛泻要方治疗，方中“抑木”组分之白芍防风善于柔肝理气止痛，“培土”组分之陈皮白术长于补脾胜湿止泻，四药合用，补脾柔肝，共奏佳效［6］。然而，目前的临床证据多关注痛泻要方整体药物的疗效及机制。基于中医理论及前期研究成果，笔者推测“抑木”组分之白芍防风是缓解内脏髙敏、改善腹部不适症状的重要部分。本研究将痛泻要方拆分为“抑木”组分与“培土”组分，以IBS-D模型大鼠为研究对象，以BDNF和SP表达为切入点，在前期证实痛泻要方有效性的基础上［18］，深入探索痛泻要方治疗IBS-D的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 于2020年7月选取6周龄SPF级雄性Wistar大鼠共32只，体质量为（190±20）g，采购于成都达硕生物技术有限公司，动物生产许可证号：SYXK（川）2020-030，饲养于标准Ⅱ级动物房，室温（21±2）℃，相对湿度（50±10）%，明暗比1∶1。适应性饲养7 d后，采用抽签法随机分为空白组、模型组、白芍防风（B-F）组和陈皮白术（C-B）组，每组8只大鼠，实验期间不限制大鼠进食、饮水。实验方案通过成都中医药大学附属医院实验动物伦理审查，伦理编号：2020DL-001。

1.2 主要试剂及药物 戊巴比妥钠（上海斯信生物科技有限公司）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海西唐生物科技有限公司，批号：WB101）、BDNF酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海西唐生物科技有限公司，批号：F15100）、SP ELISA试剂盒（上海西唐生物科技有限公司，批号：F16804）。痛泻要方组成：白术12 g、白芍8 g、陈皮6 g、防风4 g，中药由四川省中医院中药房采购于四川新荷花中药饮片公司，并由该院药剂科经浸泡、煎煮、过滤浓缩等工艺制作中药浸膏混悬液。

1.3 造模方法 参照文献［19-20］方法建造IBS-D大鼠模型，除空白组外，其余各组大鼠均采用结直肠扩张+慢性束缚应激的造模方法建立内脏敏感型IBS-D大鼠模型。结直肠扩张：将自制的气囊涂抹石蜡油后塞进大鼠肛门约7 cm，在肛门外1 cm处用胶带将其固定在大鼠尾根部，在80 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）气囊的压力下维持5 min，气囊每次使用前后均需要进行酒精消毒处理。慢性束缚应激：将大鼠仰卧位固定于束缚架（20 cm×6 cm×5 cm）上2 h，限制活动。1次/d，共14 d。使用腹部撤退反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）［21］评价模型大鼠内脏敏感性，评分越高表明腹部撤退反应越敏感；当结直肠扩张压力达到75 mm Hg及以上时，AWR评分＜3分则视为造模失败。

1.4 干预方法 按照体表面积系数换算，以成年人70 kg、大鼠200 g，换算系数6.3计算大鼠每日中药饮片用量［22］：白芍0.72 g/kg、防风0.36 g/kg、陈皮0.54 g/kg、白术1.08 g/kg。浸膏溶液浓度为：白芍0.180 g/ml、防 风 0.090 g/ml、陈 皮 0.135 g/ml、白 术 0.27 g/ml。空白组和模型组均予以5 ml/kg蒸馏水灌胃，B-F组予以白芍浸膏4 ml/kg、防风浸膏4 ml/kg灌胃，C-B组予以陈皮浸膏4 ml/kg、白术浸膏4 ml/kg灌胃，1次/d，共14 d。

1.5 观察指标及检测方法 一般状态：造模前、造模后、治疗后每14 d观察四组大鼠的精神状况、活动情况、皮毛色泽、饮食量及体质量变化情况。

大便性状：分别于造模前1 d、造模后和治疗后对每只大鼠单笼饲养，收集4 h大便，依据布里斯托大便分类法（Bristol Stool Classification）对大便进行分级评分［23］。

AWR评分：于造模后及治疗后各检测1次。检测时将自制的气囊涂抹石蜡油后塞进大鼠肛门内约7 cm，用血压计向气囊内缓慢加压，观察大鼠在20、40、60、80 mm Hg压力梯度下对气囊扩张刺激的反应，每个压力梯度测3次取评分均值，每次测量间隔5 min。AWR评分由2名不知实验分组的工作人员共同进行。

结肠和海马体组织BDNF、SP表达水平检测：采用ELISA法进行检测。治疗结束后1 d，每只大鼠按2.5 ml/kg的剂量予2%戊巴比妥钠腹腔注射，麻醉后迅速沿大鼠腹中线用剪刀剖开腹部暴露肠道，距肛门5～7 cm处取出结肠片段长约2 cm。同时用咬钳剪开大鼠颅骨，剥离完整大鼠海马体组织。将组织标本转移至-80 ℃冰箱中保存直至检测。参照试剂盒说明书操作，酶标仪测定450 nm处OD值，分别计算大鼠结肠组织和海马组织BDNF、SP表达水平。

1.6 统计学方法 采用SPSS 25.0统计学软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，方差齐时多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法；不满足正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis检验，组间两两比较采用Bonferroni法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般状态 造模前四组大鼠精神状态良好，活泼好动，情绪平和，皮毛顺滑有光泽，肛门周围较为清洁。造模后模型大鼠逐渐出现精神萎靡，活动减少，易躁动或畏惧，饮食、饮水量减少，皮毛晦暗易脱落，肛门周围有较多稀便附着，AWR评分在压力75 mm Hg及以上时均≥3分，说明造模后大鼠内脏敏感性增高，成功建立IBS-D模型大鼠，所有大鼠存活。B-F组和C-B组大鼠治疗后精神状态较治疗前有不同程度好转，活动增多，反应迅速，饮食饮水量恢复，皮毛逐渐恢复光泽，肛门周围较模型组干净。

2.2 大鼠体质量变化情况 四组大鼠初始体质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；四组大鼠造模后体质量增长量、治疗后体质量增长量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

模型组大鼠造模后、治疗后体质量增长量小于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；B-F组大鼠造模后体质量增长量小于空白组，治疗后体质量增长量大于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；C-B组大鼠造模后、治疗后体质量增长量小于空白组，同时治疗后体质量增长量大于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；B-F组及C-B组大鼠造模后、治疗后体质量增长量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 四组大鼠初始体质量和造模后、治疗后体质量增长量比较（±s，g）Table 1 Comparison of the baseline weight and the growth of weight during the modeling period and subsequent treatment between four groups of rats

表1 四组大鼠初始体质量和造模后、治疗后体质量增长量比较（±s，g）Table 1 Comparison of the baseline weight and the growth of weight during the modeling period and subsequent treatment between four groups of rats

注：a表示与空白组相比P＜0.05，b表示与模型组相比P＜0.05；B-F组为白芍防风组，C-B组为陈皮白术组

组别 只数 初始体质量 造模后体质量增长量 治疗后体质量增长量空白组 8 193.85±12.15 50.03±13.68 71.94±15.12模型组 8 196.81±11.76 24.75±5.42a 39.25±3.73a B-F 组 8 195.60±11.44 24.83±7.53a 68.58±10.71b C-B 组 8 192.46±10.01 25.73±2.73a 61.26±8.62ab F值 0.227 11.890 16.010 P值 0.877 ＜0.001 ＜0.001

2.3 大鼠布里斯托大便分类法评分 四组大鼠造模前布里斯托大便分类法评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；四组大鼠造模后、治疗后布里斯托大便分类法评分比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

模型组、B-F组和C-B组大鼠造模后布里斯托大便分类法评分高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组大鼠治疗后布里斯托大便分类法评分高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；B-F组和C-B组大鼠治疗后大鼠布里斯托大便分类法评分低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；B-F组及C-B组大鼠造模后、治疗后布里斯托大便分类法评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 四组大鼠造模前、造模后、治疗后布里斯托大便分类法评分比较（分）Table 2 Comparison of scores of the Bristol Stool Scale of rats in four groups at baseline，after the modeling period and after treatment

2.4 大鼠AWR评分

2.4.1 大鼠造模后不同压力梯度时AWR评分变化 四组大鼠造模后在气囊压力为20、40、60 mm Hg时AWR评分比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；四组大鼠造模后在气囊压力为80 mm Hg时AWR评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

造模后在气囊压力为20、40、60 mm Hg时：模型组、B-F组和C-B组大鼠AWR评分均高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组、B-F组、C-B组大鼠AWR评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 四组大鼠造模后不同压力梯度下AWR评分比较Table 3 Comparison of AWR score of rats in four groups under different pressure gradients after modeling

2.4.2 大鼠治疗后不同压力梯度时AWR评分变化 四组大鼠治疗后在气囊压力为20 mm Hg时AWR评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；四组大鼠治疗后在气囊压力为40、60、80 mm Hg时AWR评分比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

治疗后在气囊压力为40 mm Hg时：模型组、C-B组大鼠AWR评分高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；B-F组大鼠AWR评分低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

治疗后在气囊压力为60 mm Hg时：模型组大鼠AWR评分均高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；B-F组大鼠AWR评分低于模型组、C-B组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

治疗后在气囊压力为80 mm Hg时：B-F组大鼠AWR评分低于模型组、C-B组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 四组大鼠治疗后不同压力梯度下AWR评分比较〔M（P25，P75），分〕Table 4 Comparison of AWR scores of rats in four groups under different pressure gradients after treatment

2.5 大鼠治疗后结肠、海马组织BDNF表达水平 四组大鼠治疗后结肠、海马组织BDNF表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

模型组、C-B组大鼠治疗后结肠组织BDNF表达水平高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；B-F组大鼠治疗后结肠组织BDNF表达水平低于模型组和C-B组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

模型组大鼠治疗后海马组织BDNF表达水平低于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；B-F组大鼠治疗后海马组织BDNF表达水平高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表5。

表5 四组大鼠治疗后结肠、海马组织BDNF表达水平比较（±s，μg/L）Table 5 Comparison of BDNF expression levels in colon and hippocampus of rats in four groups after treatment

表5 四组大鼠治疗后结肠、海马组织BDNF表达水平比较（±s，μg/L）Table 5 Comparison of BDNF expression levels in colon and hippocampus of rats in four groups after treatment

注：a表示与空白组相比P＜0.05，b表示与模型组相比P＜0.05，c表示与B-F组相比P＜0.05

组别 只数 结肠组织 海马组织空白组 8 201.00±22.30 157.02±31.98模型组 8 257.03±39.64a 102.39±20.80a B-F 组 8 214.51±25.71b 146.65±32.90b C-B组 8 246.27±32.71ac 130.52±28.97 F值 5.701 5.376 P值 0.004 0.005

2.6 大鼠治疗后结肠、海马组织SP表达水平 四组大鼠治疗后结肠、海马组织SP表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

模型组、C-B组大鼠治疗后结肠组织SP表达水平高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；B-F组大鼠治疗后结肠组织SP表达水平低于模型组和C-B组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

模型组、C-B大鼠治疗后海马组织SP表达水平高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；B-F组大鼠治疗后海马组织SP表达水平低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表6。

表6 四组大鼠治疗后结肠、海马组织SP表达水平比较（±s，μg/L）Table 6 Comparison of SP expression levels in colon and hippocampus of rats in four groups after treatment

表6 四组大鼠治疗后结肠、海马组织SP表达水平比较（±s，μg/L）Table 6 Comparison of SP expression levels in colon and hippocampus of rats in four groups after treatment

注：a表示与空白组相比P＜0.05，b表示与模型组相比P＜0.05，c表示与B-F组相比P＜0.05

组别 只数 结肠组织 海马组织空白组 8 602.64±128.68 211.00±61.14模型组 8 931.33±303.07a 310.46±75.17a B-F 组 8 624.55±185.55b 236.96±59.49b C-B组 8 854.90±242.08ac 304.30±69.21a F值 4.305 4.402 P值 0.013 0.012

3 讨论

IBS是一种脑-肠交互紊乱的疾病，其特征是腹痛和排便习惯改变［1］。腹痛腹胀症状是内脏高敏反应的典型特征，也是辨别IBS与其他功能性胃肠疾病的重要临床症状［24］。BDNF与SP等其他脑肠肽相互作用以调节肠道感觉并影响结肠敏感性［25］。AWR评分是量化肠道敏感性的一个重要指标［26］，能够体现大鼠肠道敏感性变化情况。本研究通过拆解痛泻要方，从中枢及外周BDNF、SP表达切入，探讨痛泻要方中“抑木”组分白芍防风缓解IBS-D的内脏高敏的疗效机制。

BDNF是感知疼痛的重要调节因子［27-28］，在大脑中活跃于海马皮质，参与神经元功能的调节，适量的BDNF可以维持感觉神经的正常功能，BDNF异常升高会导致各种与疼痛相关的感觉，如慢性疼痛、炎症性疼痛和内脏痛［25］，并可能与IBS患者焦虑和抑郁症状存在关联［29］。也有充分的证据表明 BDNF 在内脏高敏反应中发挥重要作用［30］。

SP异常表达与内脏超敏密切相关［31］，其参与了内脏的痛觉传递和痛觉产生过程，在内脏高敏性及调控痛敏感中发挥作用［32-33］，海马中SP可参与情绪及应激功能调节［34］，包括压力和焦虑相关行为［35］。有研究发现在IBS-D患者肠黏膜中SP阳性细胞数目和染色强度增加，认为高表达的SP与IBS-D腹痛、腹泻症状具有显著相关性［36］。SP作为一种胃肠激素，会促进肠蠕动、增高结肠内压力，从而易引起腹泻。

痛泻要方作为治疗IBS-D常用方剂之一［18］，其能有效缓解腹痛和腹泻，并恢复患者消化道的稳态［37］。方中白术味甘苦、性温，甘以补脾胃之虚，苦温以燥湿肠中之湿；陈皮味辛苦、性温，辛温而助白术燥湿醒脾、兼而理气；白芍味酸、性微寒，可泻肝火而酸阴柔肝，以达到理肝气、缓急止痛的效果；防风味辛甘、性微温，既能辛散肝中郁气，又香醒脾气，辛温又能助白术除湿而止泻，且为脾经引经药。全方四药相配，补脾虚柔肝阴，理肠中之气，清肠中之湿，共奏止泻止痛之功。在本实验中，经过药物治疗的两组大鼠，精神状态良好，体质量增加高于模型组，表明食欲良好，受造模影响较小；此外布里斯托大便分类法评分均低于模型组，表明白芍防风药对与陈皮白术药对均有较好止泻效果。IBS-D模型大鼠AWR评分升高，表明肠道敏感性增加，治疗后B-F组在多个压力梯度下AWR评分优于C-B组，白芍防风发挥柔肝止痛之功而缓解内脏高敏。研究发现痛泻要方可通过下调SP表达，改善大便，缓解腹痛、腹泻症状，有效提高生活质量［36］。模型组中BDNF和SP在结肠内的表达显著增加，而在海马体内BDNF表达降低、SP表达增加，表明它们共同参与了IBS-D内脏高敏反应的形成。白芍防风能更显著地下调海马组织SP和结肠组织中BDNF、SP的表达，上调海马体内BDNF的表达，修复脑肠肽的平衡，缓解IBS-D症状。

综上所述，痛泻要方中白芍防风药对、陈皮白术药对均能明显增加IBS-D大鼠体质量、改善腹泻情况。相较于陈皮白术药对，白芍防风药对可更好地下调海马组织SP和结肠组织BDNF、SP的表达，上调海马组织BDNF的表达，从而改善肠道高敏状态，缓解腹泻症状。

作者贡献：王科凯、谢欣负责论文起草，并进行结果的分析与解释；王科凯、杨焱麟、周彦妮负责动物模型的制备、实验指标的检测；王科凯、吴芹萍进行数据收集、整理；肖瑾、谢欣进行统计分析、绘制图表；陈敏提出研究的构思与设计，负责研究的实施推进与可行性分析，负责最终版本修订，对论文负责。

本文无利益冲突。