基于推土距离（EMD）算法的群体生物等效性统计方法评价眼用乳剂粒径分布的一致性

徐千姿，梁月茹，赵忠卫，沈 雁**

（1中国药科大学药学院药剂系，南京 210009；2深圳奥祺生物医药有限公司，深圳 518057）

近年来，随着人们生活水平的提高，健康意识的不断增强，药品需求随之越来越大。仿制药是医疗保障系统中的重要组成部分，其价格相对低廉，拥有良好的经济效益和社会效益［1］。生物等效性（bioequivalence，BE）评价是批准仿制药的重要步骤之一［2］。体外生物等效性研究是BE研究的重要组成部分，它通常有两种统计分析方法，平均生物等效性（average bioequivalence，ABE）和群体生物等效性（population bioequivalence，PBE）［3］。PBE计算方法最早由安德森和霍克提出［4］，是对ABE方法的补充，这是由于在实际中有许多药物可能存在方差非齐性，相比于ABE 检测只比较药代动力学参数的平均水平，PBE统计方法还考虑了参比制剂和受试制剂样本间、样本内所有变异，计算更加严谨［5］。

粒径分布（PSD）通常用直方图表示，通过粒子大小和范围的信息可用于描述一些物质物理和化学特性。PSD 的分析在建立复杂药品的BE 方面已引起了广泛的关注。在FDA 官方指南中已建议使用PBE 方法对多种纳米制剂的粒径开展体外生物等效性研究，如氢氧化铁蔗糖复合物注射液［6］、二氟泼尼松眼用制剂［7］、盐酸多柔比星脂质体注射剂［8］、妥布霉素/地塞米松眼用悬浮液［9］。对于这些制剂，PBE 考察主要参数为D50、Span 或多分散系数，其中D50 指有一半的粒径直径分布小于该值，Span 用来描述分布的区间，但这些参数只局限于粒径分布是单一峰的情况［10］，当PSD图形是复杂的（即非单峰），D50/SPAN 将不足以进行分析。例如，对于存在双峰的PSD 图形，D50 可能位于两个峰之间的谷从而导致误差。针对这一问 题，FDA 在《Draft Guidance on Cyclosporine》［11］中提出了一种度量方法，称为推土距离（Earth Mover‘s Distance，EMD）算法。目前在计算机领域，已有不少研究将EMD 算法应用于图像检索、分析和模式识别等［12-13］。EMD 定义两个直方图之间的距离为一个运输问题，可用于度量两个相似分布间的差异［14］，因此可将EMD 应用于PSD 图形相似度比较，为进一步评价粒径生物等效性提供数据分析基础。

环孢素眼用乳剂（商品名：Restasis）于2002年被FDA 批准在美国上市用于干眼症的治疗［15］，获得了良好的疗效，但市场上很少有其仿制制剂，其中一个关键问题是生物等效性研究［16］。本研究以Restasis 作为研究对象，应用基于EMD 算法的PBE统计计算软件，检验开发的软件是否能通过参比制剂自身等效，并评价不同工艺下受试制剂粒径分布与参比制剂是否具有等效性，本研究不仅解决环孢素眼用乳剂控制体外生物等效性关键问题，同时也为其他乳剂、胶束、脂质体、纳米粒、微球、纳米囊等复杂仿制制剂的PSD 及PBE 评价提供参考。

1 材 料

1.1 药品与试剂

环孢素眼用乳剂参比制剂（商品名Restasis，规格0.4 mL∶0.2 mg，美国Allergan 公司）；甘油（南京化学试剂股份有限公司）；蓖麻油［罗辅医药科技（上海）有限公司］；聚山梨酯80（南京威尔药业股份有限公司）；卡波姆共聚物A 型（美国Lubrizol 公司）；氢氧化钠（西陇科学股份有限公司）；环孢素（浙江瑞邦药业股份有限公司）。

1.2 仪 器

电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；pH计（瑞士Mettler toledo公司）；恒温水浴锅（上海力辰邦西仪器科技有限公司）；Malvern nano ZSE 动态光散射仪（英国马尔文仪器有限公司）；Wiggens高速剪切机［维根技术（北京）有限公司］。

2 方 法

2.1 EMD算法

EMD 算法［10］起源于经典的货物搬运问题。对于两个离散分布P和Q，如果把这两个分布看作是总量为1 的一堆“土”的形状，那么EMD 算法反映的就是在一定限制条件下把这堆“土”从P状态搬运到Q状态所做的最小工作量。已知原始位置（xi）有“土”（pi），目标位置（yj）需求“土”（qj），则表 示 从pi运 往qj的“土”的数量；dij表示pi与qj两地的距离）。一旦找到最优解

2.2 群体生物等效性

体外群体生物等效性统计分析的研究方法是基于比较准则，计算其95%的置信区间的上限值θ，如果θ小于或等于预设的界限值θp，则表示受试制剂与参比制剂具有生物等效性。FDA 提出混合标度法［17］作为体外群体生物等效性比较的准则（population bioequivalence criterion，PBC）。

将式（1）转化为线性形式：

当σR＞σT0时选用参比标准，即η1；当σR≤σT0时，选用常数标准，即η2

为使受试产品通过PBE 试验，线性化标准（η1或η2）的95%置信上限（Hη1或Hη2）不得大于0。

2.3 环孢素眼用乳剂的制备

2.3.1 处方 参考原研制剂处方组成，制备3 批处方量为100 g 的0.05%环孢素眼用乳剂，根据前期实验结果，改变蓖麻油、吐温用量及制备工艺参数，以获得不同粒径大小及分布的制剂。

2.3.2 制备工艺 按照表1 中处方组成及用量，用20%注射用水分散卡波姆共聚物A 型作为水相1；另取70%注射用水作为水相2；将蓖麻油、聚山梨酯80、甘油、环孢素搅拌溶解均匀后作为油相；油相与水相2混合，在45 ℃条件下按表2工艺参数以高速剪切制备初乳，而后加入水相1，调节溶液pH至6.0 ~ 8.0，加注射用水至终重后即得终乳。

Table 1 Prescription composition and dosage of cyclosporin ophthalmic emulsion

Table 2 Technological parameters of cyclosporin ophthalmic emulsion

2.4 EMD-PBE统计方法

对给定的参比制剂和受试制剂PSD 数据集，首先对所有参比样本PSD 求取平均值从而得到平均参比样本PSD，作为参比中心。然后应用EMD计算单个参比样本的PSD 到参比中心的距离，如［dR1，1，1，.....，dRi，j，k，.....］，表示单个参比样本与参比中心之间的偏差。同样地，利用EMD 计算每个受试样本到参比中心之间的距离，如［dT1，1，1，.......，dTi，j，k，......］，表示单个受试样本与参考中心之间的偏差（其中i、j、k分别表示批次、样本数、重复测量次数）。随后，利用PBE 对两组EMD 进行统计检验，以建立受试制剂和参比制剂之间的BE（图1）。利用PBE 处理一个多层次的数据结构（即，批次 × 样本 × 重复测量次数）。相比于直接比较两组PSD 曲线，本文中所使用的方法通过计算EMD 降低数据的维度，由此绕过多变量比较，并且比较了受试和参比之间的差异与参比内部的差异，所得粒径等效性结果具有真实性。

在此项研究中，采用动态光散射仪，以25 ℃测量角度173 ℃条件测定制剂粒径；所有样品均用超纯水稀释10倍后置于DTS0012样品池中。每批参比制剂取3 个样本，每个样本重复测定5 次。按照以下流程进行粒径PBE计算。

Figure 1 Schematic diagram of the proposed equivalence approach

3 结 果

3.1 参比制剂内部等效性结果

在本节中，在4 批参比粒径数据集中任选2 批作为R（R：参比样本），其余2 批作为T（T：受试样本），检查所提出的方法接受等效产品的能力（例如，参比制剂本身）。图2-A 显示了将参比制剂与自身进行比较的测试结果。可以看出，两个粒径分布图是重合的，有一些局部的变化，这表明即使参比制剂本身也存在一定程度的变化。然后将所提出的方法应用于选定的两组数据。图2-B 显示了参比样本粒径分布图（橙色）和受试样本粒径分布图（青色）到参比中心（即参考样本的平均值）计算的EMD距离。可以看到两组距离具有相似的范围（即低于0.28）。最后，将PBE 应用于两组EMD距离，根据判别标准，当σR＜ 0.1 时，选用常数标准，即Hη2= -0.019 12 ＜ 0。参比制剂自身通过生物等效性验证，由此说明本研究应用的开发软件是可靠。

Figure 2 Comparison between two sets of the reference samples (two lots) by treating one of them as Test

3.2 受试制剂等效性结果

Figure 3 Comparison between the reference samples and test samples (F1-F3)

实验中，制备了不同处方用量和工艺参数的受试制剂，按照上述参数测定粒径，获得3 个受试制剂数据集，同时以4 批参比粒径数据参比数据集，分别应用EMD-PBE 统计软件进行分析。图3中A ~ C 分别表示处方F1 ~ F3 与参比制剂的PSD分布图；D ~ F 表示处方F1 ~ F3 与参比制剂EMD计算结果，可以看出，处方F1 和F2 与参比制剂的PSD 是不同的并且两者EMD 的范围也有很大的差异，同时计算结果显示两者均满足σR＜ 0.1，Hη2分别为0.005 102和0.035 99，均大于0，故未通过BE测试，由此也说明该方法具有良好的拒绝不等效产品的能力。处方F3 通过BE 测试，满足σR＜ 0.1，Hη2= -0.010 20 ＜ 0。受试制剂F1 ~ F3处方用量及工艺参数的改变对粒径大小及粒径等效性均产生影响，借助EMD-PBE 统计分析方法，为仿制药开发中处方和工艺筛选提供一定的帮助。

Table 3 Calculation results of equivalence parameters of test and reference preparations

4 讨 论

EMD 是衡量图像之间相似性的有效方法，虽广泛应用于计算机视觉应用，但使用EMD 来比较PSD 等效性未见文献报道。本研究应用基于Python 语言开发的EMD-PBE 统计分析软件，操作简单快捷，从上述结果可知该分析方法可有效通过粒径等效产品，拒绝不等效产品，为仿制制剂处方及工艺开发提供依据。

基于EMD的体外群体生物等效性的统计分析中，还有一部分内容可进一步深入研究：一是研究对象的选择，二是样本量的确定。本研究对象环孢素眼用乳剂粒径范围广泛［18］（从几纳米到几十微米不等），导致其PSD 非完全单峰，故应用该统计方法分析PSD 是准确且可信的。在后续研究中，可选择更多其他呈现复杂粒径分布的纳米制剂进行评价。FDA 在布地奈德吸入剂草案（draft）中指出样本数量应选择不少于受试制剂和参比制剂各3 个批次，每个批次10 个样品数（即≥30 个样品）进行统计分析，并且每个样本进行3个阶段（包括制剂寿命初期、中期和末期）的研究，但是Chow等［19］认为 30 个样品数并不足以达到期望功效（80%），提高功效的方法有增加样品量或对于每个样品重复测量，目前对于样品量的计算暂无特定的指导标准。本研究中，由于参比制剂数量受限，故对每批参比制剂的每个样本重复测定5 次以提高功效，此外结合Hu 等［10］的计算，笔者认为这里的生命周期可以理解为重复测定次数。