热休克蛋白90α激活PI3K/Akt通路介导乳腺癌他莫昔芬耐药的机制研究①

董 毅 徐贵颖 马牧松 刘 涛（吉林省肿瘤医院乳腺外二科，长春 132000）

乳腺癌是最常见的癌症类型，也是全球女性癌症相关死亡的主要原因［1］。雌激素受体α（estrogen receptor α，ERα）过度表达是ERα+乳腺癌的特征之一，且ERα+乳腺癌是一种主要的乳腺癌亚型［2］。ER是一种激素转录因子，通过与雌激素结合而被激活，促进细胞周期进程［3］。内分泌治疗是ERα+乳腺癌患者的常规治疗方法［4］。他莫昔芬（tamoxifen，TAM）是一种常用的激素治疗药物，通过与雌激素竞争与ER蛋白的结合抑制ER转录程序［5］。TAM虽然大大改善了乳腺癌患者的预后，但在临床治疗过程中经常观察到新发和获得性的TAM耐药，导致乳腺癌复发或转移，最终导致患者死亡［6］。PI3K/Akt通路是癌症中最频繁激活的通路之一，也是癌细胞产生耐药性的最重要原因之一［7］。PI3K蛋白具有丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）激酶和磷脂酰肌醇激酶双重活性。细胞内PI3K的激活因子通过招募衔接蛋白促进p110和p85结合以激活PI3K。活化的PI3K可将3，4-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）转化为3，4，5-三磷酸（PIP3），PIP3作为第二信使可与磷酸肌醇依赖性激酶-1（PDK1）结合，在Thr308处磷酸化Akt。Akt也可在Ser473处被mTORC2磷酸化。Akt是关键的信号转导蛋白，可磷酸化多种底物和下游效应物，并使癌细胞产生耐药性。基于此，本研究将以乳腺癌细胞HCC1937和MCF7为研究对象，通过高通量测序和siRNA筛选鉴定乳腺癌细胞TAM耐药的关键分子。

1 材料与方法

1.1 材料PI3K/Akt通路抑制剂Pectolinarin（货号：S3056）和Miltefosine（货号：S9054）、TAM（货号：S1238）购自Selleck公司；人乳腺癌细胞HCC1937、MCF7（货号：CL-0093、CL-0149）购自Procell公司、Li‐pofectamine 3000（货号：L3000001）购自北京索莱宝科技有限公司；siRNA、miR-5003-3p inhibitor、miR-5003-3p mimics和miRNA模拟物的适当阴性对照购自南京金斯瑞；TRIzol RNA Kit（货号：16096040）购自北京华威锐科化工有限公司；SuperScriptⅡ逆转录酶（货号：18064022）购自北京冬歌博业生物科技有限公司；iTaq Universal Probes Supermix（货号：1725131）购自武汉佰法生物科技有限公司；AO/EB染色试剂盒（货号：E607308-0200）购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与处理 人乳腺癌细胞HCC1937和MCF7培养于含10%胎牛血清（FBS）、50活性单位/ml青霉素和50 µg/ml链霉素的RPMI1640培养基中。TAM抗性细胞系HCC1937/TR和MCF7/TR通过与浓度逐步增加的TAM孵育衍生而来。处理HCC1937和MCF7细胞的TAM剂量从0.001 µmol/L增加到0.1µmol/L，处理12个月以上。处理过程中，每轮处理后，当存活细胞达到>70%汇合时，进行胰酶消化传代，并增加TAM剂量。根据制造商说明书，将HCC1937/TR和MCF7/TR细胞接种于12孔板孵育24 h以达到30%~40%的汇合度，并使用Lipofectamine3000以HSP90α siRNA或对照siRNA siGFP瞬时转染细胞。

1.2.2 RNA提取与实时荧光定量PCR TAM处理48 h后，使用TRIzol RNA Kit提取总RNA。总RNA使用SuperScriptⅡ逆转录酶生成cDNA。PCR使用iTaq Universal Probes Supermix以20 µl的最终反应体积进行3次重复，使用基因特异性引物/探针组和标准热循环程序（35个循环）在Bio-Rad CFX96TM实时PCR系统上进行。通过比较Ct方法（ΔΔCt）确定目标转录物的相对定量。在没有逆转录的情况下进行对照实验以确认总RNA没有被基因组DNA污染。以GAPDH为HSP90α的内参，U6为miRNA的内参。

1.2.3 蛋白免疫印迹 过表达或敲低miR-5003-3p 48 h后（或过表达或敲低HSP90α 48 h后），以细胞裂 解 液（0.1%SDS、1%NP-40、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris-HCl）裂解。采用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白质进行定量。蛋白质样品通过10%SDSPAGE电泳分离，并转移至聚偏氟乙烯膜（0.45µm）。室温下用含5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS-Tween-20（PBST）封闭膜60 min。与GAPDH、HSP90α、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt抗体4℃孵育60 min。进一步与二抗在室温下孵育60 min。随后进行化学发光反应。

1.2.4 细胞周期检测TAM处理48 h后，采用流式细胞术进行细胞周期分析。使用FACS CantoⅡ流式细胞仪在405 nm下分析含胰蛋白酶化黏附物的样品，并使用450/50带通滤光片收集细胞发射物。进一步使用FlowJo V10软件分析结果，确定细胞周期分布。

1.2.5 细胞凋亡水平检测TAM处理48 h后，AO/EB法检测细胞凋亡。然后根据制造商说明书，以AO/EB染色细胞，于200倍放大的FV300/FV500激光扫描共聚焦显微镜下检查。凋亡细胞表现为核凝结和碎裂。

1.2.6 细胞活力检测TAM处理48 h后，MTT法检测细胞活力。将8×103个细胞接种于96孔板培养24 h，然后用不同浓度的药物处理。孵育48 h后，使用3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯四唑溴化铵（0.5 mg/ml）和Bio-Tec酶标仪在562 nm波长下检测细胞活力。

1.2.7 高通量测序TAM处理48 h后，使用TRIzol RNA Kit提取总RNA；使用NuGEN Ovation RNA System V2和NuGEN Ultra Low library System V2制备RNA-seq文库；使用RNA-Seq系统（NuGEN）对RNA-seq文库进行测序；使用Qubit和Agilent Bioan‐alyzer 2100分析评价扩增文库的质量和数量。

1.2.8 荧光素酶报告实验HSP90α-γ基因的3′-非翻译区（UTR）在与GV126荧光素酶基因融合前进行PCR扩增。HSP90α基因和miR-5003-3p的结合位点通过定点突变切除作为对照。胸苷激酶启动子和表达海参荧光素酶的质粒用于调整转染效率。采用荧光素酶报告载体将miR-5003-3p mimics和对照共转染至MCF7细胞，并进行荧光素酶实验。

1.3 统计学分析 所有实验重复3次。采用学生t检验和单因素方差分析（One-Way ANOVA with post-hoc Tukey's test）比较不同组的数据。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TAM抗性的人乳腺癌细胞HCC1937和MCF7的构建TAM处理可显著抑制亲本细胞的增殖并诱导细胞凋亡，但不能抑制抗性细胞，见图1A~C。此外，经TAM处理后，HCC1937/TR和MCF7/TR细胞周期阶段的分布发生显著变化。TAM处理可在HCC1937和MCF7细胞中显著诱导G1期停滞，但在HCC1937/TR和MCF7/TR中则不然，见图1D、E。提示已成功筛选出TAM抗性细胞（HCC1937/TR和MCF7/TR）。

图1 TAM抗性的人乳腺癌细胞构建Fig.1 Construction of TAM-resistant human breast cancer cells

2.2 HSP90α激活PI3K/Akt通路引起乳腺癌细胞TAM耐药 将TAM处理和未处理的HCC1937/FR细胞进行高通量测序，发现TAM处理后，多个基因的表达水平被调节（图2A）；通过siRNA筛选，发现当敲低HSP90α时，HCC1937/FR细胞凋亡水平升高（P<0.05，图2B）；过表达HSP90α后，HCC1937/TR和MCF7/TR细胞凋亡水平降低（P<0.05，图2C、D）；敲低HSP90α后，MCF7/TR细胞凋亡水平显著升高（P<0.05，图2E）；在HCC1937和MCF7细胞中过表达HSP90α后采用TAM处理，HCC1937和MCF7显示出对TAM抑制增殖的抵抗（P<0.05，图2F、G）；敲低HSP90α后，PI3K/Akt通路受到抑制（图2H）；过表达HSP90α后，PI3K/Akt通路 激活（图2I）；使 用PI3K/Akt通路抑制剂Pectolinarin或Miltefosine处理后，再用TAM处理，HCC1937/TR和MCF7/TR细胞凋亡水平显著升高（P<0.05，图2J）。

图2 HSP90α激活PI3K/Akt通路引起乳腺癌细胞TAM耐药Fig.2 HSP90α activates PI3K/Akt pathway to cause TAM resistance in breast cancer cells

2.3 miR-5003-3p靶 向HSP90α介导 乳 腺癌细胞TAM耐 药TAM处 理HCC1937/TR和MCF7/TR细胞 后，HSP90α mRNA水 平 均 升 高（P<0.05），但HSP90α转录水平无明显变化（P>0.05，图3A、B）；miRDB在线分析发现，有多个miRNAs靶向HSP90α，TAM处理后，MCF7/TR细胞中miR-5003-3p表达水平降低（P<0.05，图3C）；TAM处理后，HCC1937/TR细胞中miR-5003-3p表达水平降低（P<0.05，图3D）；在HCC1937/TR和MCF7/TR细胞中过表达miR-5003-3p后，HSP90α表达水平降低（P<0.05）；敲低miR-5003-3p后，HSP90α表达水平升高（P<0.05），见图3E；TAM处理后过表达miR-5003-3p，HCC1937和MCF7凋亡水平升高（P<0.05）；TAM处理后并敲低miR-5003-3p，HCC1937和MCF7细胞凋亡水平降低（P<0.05），见图3F、G；同时，miR-5003-3p靶向HSP90α的3'UTR区（图3H）；此外，敲低miR-5003-3p后，PI3K/Akt通路激活（图3I）；过表达miR-5003-3p后，PI3K/Akt通路受到抑制（图3J）。

图3 miR-5003-3p靶向HSP90α介导乳腺癌细胞TAM耐药Fig.3 miR-5003-3p targeting HSP90α mediates TAM resistance in breast cancer cells

3 讨论

在过去的几十年，TAM是ER阳性乳腺癌最常见、最有效的内分泌治疗药物，显著提高了乳腺癌患者生存率［1］。然而，有30%~40%接受抗雌激素治疗的患者最终对TAM产生耐药性并导致复发，这是乳腺癌死亡的主要原因之一［8］。

本研究通过TAM梯度处理成功获得HCC1937/TR和MCF7/TR细胞。通过高通量测序和siRNA筛选鉴定了与乳腺癌细胞耐TAM的关键分子HSP90α。当敲低HSP90α时，HCC1937/FR细胞凋亡水平升高。过表达HSP90α后，HCC1937/TR和MCF7/TR细胞凋亡水平显著降低。敲低HSP90α后MCF7/TR细胞凋亡水平显著升高。在HCC1937和MCF7细 胞 中 过 表 达HSP90α并 用TAM处 理，HCC1937和MCF7显示出对TAM抑制增殖的抵抗（P<0.05）。HSP90α蛋白被称为癌症伴侣蛋白，是参与增殖、分化、凋亡、血管生成、转移、肿瘤发生、遗传变异等必要信号转导通路的蛋白质分子伴侣［9］。有研究报道，HSP90α在乳腺癌中的表达增加与细胞存活增加和预后不良相关［10］。此外，HSP90α抑制剂作为乳腺癌治疗的临床试验正在进行中［11］。因此，HSP90α抑制剂与TAM联合使用可能改善乳腺癌患者的预后。

据报道，内质网突变、内质网共激活因子上调、致癌途径激活等机制可导致内分泌治疗的耐药性［12-13］。尤其是TAM耐药乳腺癌细胞可能通过激活PI3K/Akt/mTOR和EGFR-MAPK信号通路克服药物诱导的细胞生存和增殖抑制［14］。敲低HSP90α后，PI3K和Akt的总体表达水平无明显变化，但磷酸化的PI3K和Akt表达水平降低，说明PI3K/Akt通路受到抑制；PI3K/Akt通路抑制剂Pectolinarin或Miltefo‐sine处理后，再用TAM处理，HCC1937/TR和MCF7/TR细胞凋亡水平显著升高。提示HSP90α通过激活PI3K/Akt通路引起乳腺癌对TAM的抗性。PI3K/Akt通路包括具有三个关键调控节点的细胞内信号转导酶家族：PI3K、Akt和mTOR［15］。PI3K可被多种信号激活，随后活化Akt［16］。激活后，p110 PIK3CA磷酸化磷脂酰肌醇PIP2以形成磷脂酰肌醇PIP3。Akt与PIP3的结合导致Akt从细胞质易位到质膜，其中3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）和Akt的共定位允许PDK1在苏氨酸308处磷酸化Akt。Akt的完全激活需要其在S473处被mTOR/Rictor复合物2（mTORC2）磷酸化。激活后，Akt磷酸化大量下游底物，这些底物通过调节mTOR/Raptor复合物1（mTORC1）活性调节细胞生长和蛋白质合成，随后增加增殖/细胞周期进程，抑制细胞凋亡，促进乳腺癌对TAM的抵抗。

miRNAs是真核生物中具有转录后调控基因表达功能的一类非编码小RNA［17］。本研究中，TAM处理后MCF7/TR和HCC1937/TR细胞中miR-5003-3p表达水平降低（P<0.05）。在HCC1937/TR和MCF7/TR细胞中，过表达miR-5003-3p后HSP90α表达水平降低；敲低miR-5003-3p后，HSP90α表达水平升高。TAM处理后过表达miR-5003-3p，HCC1937和MCF7凋亡水平升高（P<0.05）；TAM处理后并敲低miR-5003-3p，HCC1937和MCF7凋亡水平降低。此外，敲低miR-5003-3p后，PI3K/Akt通路激活。过表达miR-5003-3p后，PI3K/Akt通路受到抑制。越来越多的证据表明，miRNA在肿瘤起始和恶性进展过程中发挥重要作用［18-19］。因此，基于miR-5003-3p的新抗癌疗法能够改善如乳腺癌患者TAM耐药问题。

综上所述，在受到持续化疗药物TAM处理后，乳腺癌细胞HCC1937和MCF7中靶向HSP90α mRNA的miR-5003-3p表达水平降低，HSP90α表达水平上升后激活PI3K/Akt通路，最终引起乳腺癌细胞对TAM的耐药。