川芎嗪对人非小细胞肺癌耐药细胞株A549/DDP的相关ATP结合盒转运体表达水平的影响

王小梅，薛春苗，王艳梅，梁 玲，张寒蕾，梁 艳

（北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

对于进展期肺癌，尽管分子靶向治疗和免疫疗法逐渐兴起，并已获得良好疗效，但均会发生耐药，最终还是要考虑化疗［1］。因此，化疗在非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗中所占比例仍然较大。铂类（含顺铂）是NSCLC化疗的主要药物，一线化疗方案中多与之联合应用［2］。而化疗药物获得性耐药的发生，是导致NSCLC治疗失败、疾病进展和预后不良的主要原因［3］。其主要机制是ATP结合盒转运体（ABC）家族中与耐药相关的ABC（ABCB1、ABCC1和ABCG2）表达过量［4］。虽然针对ABCB1、ABCC1和ABCG2抑制剂的研究一直在继续，也产生了一些抑制剂（如Tariquidar等），但在临床实验中均遭遇了失败，使得耐药问题没有得到缓解［5］。中药涵盖物质广泛，针对肿瘤耐药，中药也有许多单体和复方可发挥逆转效果［6］。其中川芎嗪联合环孢素A不仅对多药耐药的K562/DMR细胞有明显增敏作用，还能直接逆转HepG2/ADM细胞的耐药性［7-9］。但是，川芎嗪逆转A549耐顺铂细胞药株（A549/DDP）对顺铂耐药的机制尚不明确，本研究以人NSCLC耐顺铂细胞株A549/DDP为模型，通过研究川芎嗪对ABCB1、ABCC1和ABCG2表达水平的影响，研究其逆转耐药的作用机制，为开发化疗耐药逆转药物提供参考。

1 实验仪器和材料

1.1 实验仪器

恒温培养箱（美国赛默飞世尔公司，HERACell 150i），液氮储存系统（美国赛默飞世尔公司，LOCATOR 6 PLUS），洁净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司，HDLDL-CJ-2ND I），倒置显微镜（日本奥林巴斯公司，IX7），低温高速离心机（美国西格玛公司，3K15），酶标仪（美国普洛麦格公司，E9032），电泳电转系统及凝胶成像系统（美国伯乐公司，Universal HoodⅡ），分析天平（德国赛多利斯公司，R200D），超纯水一体化系统（德国Milli-Q Integral公司），电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司，DZKW-4），恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司，DHG-9140H），聚合酶链式反应（PCR）仪（美国赛默飞世尔公司，2720型）。

1.2 实验材料

1640培养基（美国英杰生命技术有限公司，批号19217008），胎牛血清（美国依科赛生物公司，批号430790），0.25%胰酶消化液（美国英杰生命技术有限公司，批号25200056），青霉素-链霉素混合液（美国英杰生命技术有限公司，批号15140122），磷酸盐缓冲液配液盐（北京索莱宝公司，批号CB3409949，按说明配制后高温高压消毒备用），细胞计数套装8检测试剂盒（日本同仁化学研究所，批号CK04-500），全蛋白提取试剂盒（南京凯基生物有限公司，批号KGP902），BCA蛋白定量试剂盒（南京凯基，批号KGP902），6孔板、25 cm2细胞培养瓶、15 mL离心管、细胞刮刀等（美国Corning公司），离心管、移液枪头（美国Axygen公司），移液枪（1000、500、200、100、20、10μL等规格）（德国eppendorf公司），0.45μm膜（德国Meck Mllipoore公司），显影液［美国伯乐（BIO-RAD）公司］，日本TOYOBO抗体稀释液，北京普利莱公司分离胶和浓缩胶缓冲液、30%丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液、过硫酸铵、四甲基乙二胺（TEMED）、封闭液、灯神缓冲盐溶液（TBS）、洗膜缓冲液（TBST），总RNA抽提剂（Trizol）、M-MLV逆转录酶、脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）、核糖核酸酶（RNase）抑制剂、聚合酶链式反应（PCR）引物。

1.3 药物与细胞

顺铂（美国Bioruler公司，批号RH66694-100 mg，纯度＞99.9%），ABC抑制剂Tariquidar（美国Selleck公司，批号S8082，20mg），川芎嗪标准品（美国Bioruler公司，RB14186-20 mg，纯度＞99.8%）；ABCB1单克隆抗体（批号13342）、ABCC1单克隆抗体（批号72202）、ABCG2单克隆抗体（批号42078）均购自美国Cell Signal Technology公司；β-actin单克隆抗体（批号60008-1-Ig），羊抗兔二抗（批号SA00001-2），羊抗鼠二抗（批号SA00001-1）均购自美国Proteintech公司。

人肺腺癌细胞株A549，购于上海ATCC细胞库；A549/DDP购于北京北纳联创生物技术研究院。以上细胞储存条件均为液氮存储。

2 实验方法

2.1 细胞培养及耐药性测定

A549细胞和A549/DDP细胞复苏后均用1640完全培养基（含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗）培养，生长至85%融合度时，传代培养。A549/DDP细胞传代后，用含有6.67μM DDP的1640完全培养基培养，以维持其对顺铂的耐受性。实验均取对数期细胞进行，A549/DDP细胞实验前用不含DDP的1640培养基培养3 d。

取对数期A549细胞，按照5000个/孔的浓度接种于96孔板，恒温培养箱贴壁生长12 h后加入梯度浓度顺铂（6.25、12.50、25.00、50.00、100.00μM），每个梯度设5个复孔，恒温箱孵育24 h后每孔加入CCK-8溶液10μL，恒温箱孵育60 min后读取450 nm处光密度（OD）值。根据试剂盒说明计算细胞活性，用GrapfPad Prism 8.0回归分析计算半数抑制浓度（IC50）。用较大梯度浓度顺铂（125、250、500、1000、2000μM）测定A549/DDP细胞对顺铂的IC50，方法同A549细胞。A549/DDP的耐药指数=IC50（A549/DDP）/IC50（A549）。

2.2 川芎嗪对A549/DDP细胞的毒性分析

随着川芎嗪浓度的增加，其对细胞的毒性也呈现递增，通过A549/DDP细胞量效毒性分析，遴选出用于发挥逆转耐药效果的工作浓度。取对数期A549/DPP细胞，按照10 000个/孔接种于96孔板，贴壁生长12 h后，加入含梯度浓度（50、100、150、200、250μM）川芎嗪的1640培养基，每个浓度梯度设置5个复孔。37℃恒温孵育24 h后加入CCK-8溶液，孵育60 min后读取450 nm处OD值。根据试剂盒说明计算细胞活性。

2.3 川芎嗪逆转A549/DDP细胞对顺铂的耐药性

取对数生长期A549/DDP细胞，5000个/孔接种于96孔板，贴壁生长12 h后更换含有工作浓度川芎嗪的培养基，孵育24 h后加入梯度浓度（125、250、500、1000、2000μM）顺铂，孵育24 h后同前法计算IC50，逆转指数=IC50（A549/DDP）/IC50（A549/DDP-TMP）。

2.4 免疫印迹法（Western Blot）和RT-PCR实验分组及处理

在Western Blot实验和RT-PCR实验中均设置空白组、模型组、实验组和阳性对照组。空白组取对数生长期A549细胞接种于6孔板，模型组、实验组和阳性对照组均取对数生长期A549/DDP细胞接种于6孔板，以上各组均设置3个复孔。贴壁生长12 h后分别给药：空白组和模型组更换1640完全培养基，实验组更换含有100μM川芎嗪的1640完全培养基，阳性对照组更换含有1μM Tariquidar的1640完全培养基，孵育24 h后进行下一步研究。

2.5 Western Blot检测耐药相关蛋白的表达

实验各组按2.4步骤处理后，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）将细胞洗3遍，6孔板每孔加入150μL含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，反应30 min后用细胞刮刀刮取细胞，移入1.5 mL离心管中，4℃，12 000 r/min离心30 min，吸取上清液移入新的离心管中。依据BCA蛋白定量试剂盒操作说明制作标准曲线，测定待测样品蛋白浓度，并调整至统一的蛋白浓度。蛋白浓度调整后加入同体积2×加样缓冲液，沸水水浴5 min变性后放冰上冷却，-80℃保存待用。以上操作均在冰上完成。

根据所测蛋白分子量配制相应浓度分离胶，加样后分别进行电泳和电转移，封闭液封闭60 min后与一抗（稀释比为ABCB1 1∶1000、ABCG2 1∶1000、ABCC1 1∶1000，β-actin 1∶1000）孵育过夜，TBST冲洗3遍，然后与二抗（稀释比为羊抗兔二抗1∶20 000、羊抗鼠二抗1∶20 000）孵育30 min，孵育结束后TBST再冲洗3次，冲洗结束后加预配的增强型化学发光试剂（ECL）显影2 min、拍照。ImageJ软件分析相对蛋白含量，用各条带灰度值/内条带的灰度值表示。实验独立重复2次。

2.6 RT-PCR检测耐药相关ABC转运蛋白mRNA表达

实验各组按2.4步骤处理后，弃去培养基，加入预冷的Trizol，每孔1 mL，冰上孵育30 min后使用细胞刮刀刮取细胞，移入1.5 mL离心管中。每管加入45μL无RNase的水，溶解RNA。取0.2 mL薄壁PCR管，分别编号。向各管中加入含染料2×聚合酶混合物（Ex TaqMix）12.5μL、10μM引物混合物0.75μL（见表1）、对应的cDNA各1μL，其中一管不加模板用作阴性对照，各管补加水至25μL。混匀后置于PCR仪中，95℃5min预变性，95℃10s→60℃30s→72℃30 s，40次循环，4℃暂停。120 V电压下电泳20 min，电泳结束后在凝胶紫外分析仪照相。结果采用2△△CT值相对定量法表示，△CT值=各样本目的基因CT值-相对应的内参基因CT值，△△CT值=（各样本△CT值-对照△CT值）/2。2△△CT值表示各样本目的基因表达情况。

表1 逆转录-聚合酶链反应引物信息

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 A549/DDP细胞对顺铂的耐药性

顺铂作用于A549细胞株，IC50为（28.33±3.19）μM；作用于A549/DDP细胞株，IC50为（983.43±101.67）μM。A549/DDP细胞对顺铂的耐药指数为34.71（图1）。A549/DDP细胞株是由A549细胞株经梯度浓度顺铂长期培养获得。

图1 人非小细胞肺癌A549/DDP对顺铂的耐药性

3.2 川芎嗪对A549/DDP细胞的毒性

本研究所遴选的逆转耐药川芎嗪浓度，对A549/DDP细胞活性无明显抑制作用。当川芎嗪浓度低于150μM时，A549/DDP细胞活性无明显受抑（图2A），后续逆转耐药实验中，均遴选100μM作为川芎嗪逆转耐药的工作浓度。同时选取Tariquidar作为p-糖蛋白抑制剂阳性对照。工作浓度川芎嗪孵育过的A549/DDP细胞，其顺铂IC50为（128.10±12.29）μM（图2B），其逆转指数为7.68。1μM浓度Tariquidar孵育过的A549/DDP细胞，其顺铂IC50为（171.19±15.66）μM（图2C），其逆转指数为5.74。

图2 川芎嗪逆转人肺腺癌A549/DDP耐药效果

3.3 川芎嗪对A549/DDP细胞耐药相关蛋白表达的影响

Western Blot实验结果可见ABCB1、ABCC1和ABCG2条带在空白组、模型组、实验组和阳性对照组的印迹（图3A）。模型组ABCB1、ABCC1和ABCG2的表达水平均显著高于空白组，差异均具有统计学意义（P＜0.05），实验组和阳性对照组ABCB1、ABCC1和ABCG2的表达水平均显著低于模型组，差异均具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），见图3B-D。

3.4 川芎嗪对A549/DDP细胞耐药相关蛋白mRNA表达的影响

RT-PCR实验结果显示，模型组ABCB1、ABCC1和ABCG2 mRNA的表达水平均显著高于空白组，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），实验组和阳性对照组ABCB1和ABCC1 mRNA的表达水平均低于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.01），实验组和阳性对照组ABCG2 mRNA的表达水平与模型组相比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图3E-G。

图3 川芎嗪对人肺腺癌A549/DDP细胞耐药蛋白表达的影响

4 讨论

肺癌是世界范围内发病率最高的恶性肿瘤［10］，NSCLC约占全部肺癌的83%。临床治疗中，早期（Ⅰ期和Ⅱ期）患者化疗所占比例约为25%，进展期（Ⅲ期和Ⅳ期）患者化疗所占比例约为53%［11］。进展期肺癌以内科治疗为主，包括针对敏感基因突变的靶向治疗、免疫检测点抑制剂单药或联合治疗、化疗等［2］。当疾病进展或患者确定为非敏感人群时，化疗仍发挥重要作用，而化疗获得性耐药的发生，将导致治疗失败。获得性耐药产生的机制主要包括：ABCB1、ABCC1和ABCG2表达增加，细胞内的药物泵出增多导致细胞内药物浓度下降；药物吸收特性改变导致细胞内药物减少；药物的代谢速度增快；药物的靶点改变；细胞周期检测点和凋亡通路改变阻碍细胞死亡等［11-12］。与获得性耐药相关的蛋白，除ABC转运体外，还有肺耐药相关蛋白（LRP）、谷胱甘肽S转移酶（GSTs）和DNA拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）等［13］，这些蛋白在药物代谢的不同阶段导致耐药的发生。在上述机制中，耐药相关的ABC表达增加被认为是最重要的机制，是临床疗效减弱和治疗失败的主要原因［14-15］。ABC转运体家族中参与肿瘤耐药的亚型主要包括ABCB1、ABCG2和ABCC蛋白亚家族［16-22］。ABC转运体利用ATP水解的能量将底物（抗癌药物）转运出肿瘤细胞，使药物作用下降，导致获得性耐药的发生［23］。因此，需要进一步扩宽视野，兼顾人工合成与天然药物筛选，并在天然药物基础上进行加工修饰［24］。

川芎活血行气、祛风止痛，临床多用于闭塞性脑血管疾病等［25］。川芎嗪是从川芎中分离出的主要有效成分。在体外实验中能抑制恶性肿瘤的侵袭与转移，直接抑制人NSCLC耐顺铂细胞株A549/DDP并诱导其凋亡［26］，同时还能逆转耐药肿瘤细胞的耐药性［26－30］。

本研究通过对比人NSCLC细胞株A549及其顺铂耐药细胞株A549/DDP对顺铂的耐受性，确定A549/DDP细胞的耐药指数，并应用细胞增殖活性研究，遴选既能发挥逆转耐药又不影响细胞活性的川芎嗪工作浓度。该工作浓度的川芎嗪对A549/DDP的顺铂耐药性有明显逆转作用。Western Blot实验和RT-PCR实验证明，川芎嗪能下调A549/DDP细胞ABCB1、ABCC1和ABCG2的表达水平以及ABCB1、ABCC1 mRNA的表达水平，但对ABCG2 mRNA的表达水平无下调作用，其调节ABCG2的表达可能是在转录后水平实现的。本研究进一步揭示了川芎嗪逆转肿瘤化疗的机制，为开发新药提供了线索。