基于肠道菌群探究化铁丸抗结肠癌作用机制

谢 辉，周红光，李 黎，李沐涵，李文婷，周洪立，陈海彬，3

（1.河南中医药大学，河南 郑州 450046；2.南京中医药大学第一临床医学院肿瘤研究所，江苏 南京 210000；3.南京中医药大学科技处实验动物中心，江苏 南京 210000）

结肠癌在世界范围内较为常见，在所有恶性肿瘤类型中男性和女性发病率分别排名第二和第三［1］，病死率排第二位［2］。人体肠道内微生物的种类与数量繁多，环境复杂，微生物群落结构或数量的改变，都会影响肠道生理功能［3］。人体肠道内约有100万亿种微生物，包括细菌、真菌、古菌、原生生物以及病毒。肠道微生物失衡会影响免疫系统、代谢产物以及信号通路之间的联系，从而导致肠道肿瘤的发生和发展［4-6］。目前已经证实中医药在抑制结肠癌的发生中起重要作用，调节肠道微生物是治疗结肠癌的新疗法。如Zhang等［7］研究发现，蚕梅方可调节肠道微生物群中有益菌、有害菌的组成，减少小鼠结肠炎症，从而抑制结肠癌发生；Lv等［8］发现葛根芩连汤通过重塑肠道微生物群和肿瘤微环境，增强程序性死亡受体-1（PD-1）抑制剂在结肠癌中的疗效；Sun等［9］发现祛邪胶囊参与肠道菌群及T细胞功能调节，改善转移性结肠癌患者临床症状。中药方剂化铁丸出自《普济方》，由威灵仙、楮实子组成，主治腹中痞积。已有研究表明，方中威灵仙可提高免疫力，楮实子可降低炎症因子水平、改善肠屏障功能［10-12］。化铁丸能否抑制结肠癌发展，其具体机制是什么，目前尚无明确动物实验依据。本研究通过建立结肠癌HCT116移植性裸小鼠模型，分析经化铁丸处理后各裸小鼠的菌群差异，从肠道菌群角度探讨其治疗结肠癌的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及动物

HCT116结肠癌细胞购于上海中乔新舟公司，样本号20170303-06，细胞号对应号CCL-247。SPF级雄性BALB/c裸小鼠36只，5～6周龄，体质量（18.54±2.36）g，购自扬州大学比较医学中心，许可证号SYXK（苏）2017-0007，货号202008557。饲养于南京中医药大学动物饲养中心，设置室温为22～23℃，相对湿度为60%～70%，每日光照与黑夜各12 h交替。动物实验由南京中医药大学动物伦理委员会批准（批准号202008A009）。

1.2 药物与试剂

化铁丸由威灵仙15 g、楮实子15 g组成，药材购自江苏省百草堂（批号分别为191101、191120），由南京中医药大学药学院王爱云教授鉴定均符合2015年版《中华人民共和国药典》要求。细胞培养基（高糖，DMEM）购自Biological Industries公司（批号01-052-1ACS）；胎牛血清购自Biological Industries公司（批号04-001-1ACS）；无钙离子磷酸盐缓冲液（PBS）购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 分组及造模

1.3.1 药物制备

将化铁丸整方药材置于容器内加10倍体积水，浸泡2 h后大火煮开，再小火煮1 h，取滤液。药渣加8倍体积水继续煮1 h，取滤液。将两次滤液混合均匀后浓缩成生药量2 g/mL的药液，储存备用。

1.3.2 肿瘤细胞培养及结肠癌移植瘤模型的建立

结肠癌HCT116细胞培养于含10%胎牛血清DMEM的培养基中，于37℃恒温培养箱中培养。当细胞培养至80%的对数生长期时，用含0.25%胰蛋白酶消化传代，隔1～2 d传代1次。当细胞处于对数生长期时用PBS把细胞浓度调至每毫升2×107个，注射0.2 mL到裸小鼠右腋下，SPF条件下饲养8～10 d，右腋皮下有肉眼可见的米粒大小瘤块为造模成功。

1.3.3 分组及给药

剔除造模不成功的4只裸小鼠后，将造模成功的32只裸小鼠随机分成对照组及化铁丸低、中、高剂量组，每组8只。对照组予生理盐水灌胃；按照成人和小鼠之间体表面积等效剂量换算公式将临床成人的常规使用剂量换算成裸小鼠的等效剂量作为中剂量给药量，即裸小鼠低剂量为1.82 g/（kg·d），中剂量为3.64 g/（kg·d），高剂量为14.56 g/（kg·d）灌胃，每日1次，每次每只0.2 mL，连续给药21 d。

1.4 裸小鼠的一般状态

每日观测裸小鼠的精神状况、活动、饮食饮水量；用药组与对照组瘤体积开始有显著性差异后，收集各组裸小鼠粪便，放入冻存管，-80℃冰箱中保存。

1.5 裸小鼠移植瘤体积及药物抑瘤率

自首次给药起，每隔3 d用游标卡尺测量裸小鼠移植瘤的长轴（a）和短轴（b），并根据公式V=1/2ab2计算瘤体体积。末次给药24 h后处死所有裸小鼠，剥离瘤组织，称量瘤重。统计各组抑瘤率（IR），IR=（1-用药组瘤重/对照组瘤重）×100%。

1.6 生物信息学分析

将抑瘤率最高的给药组与对照组裸小鼠粪便交由上海市凌恩生物科技有限公司进行16SrDNA测序，运用Illumina Nova Seq高通量测序平台对各组细菌16SrRNA基因V3～V4区进行测序。使用QIIME程序对序列进行生物信息学分析，uParse软件对有效数据在97%水平的操作分类单元（OTU）行聚类分析。根据OTU结果，以微生物多样性分析比较组间菌群差异；根据LDA值分布柱状图和LEfSe多级物种差异，判别筛出对差异有影响的物种。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 化铁丸对结肠癌HCT116裸小鼠移植瘤的抑制作用

2.1.1 各组裸小鼠生存状态及体质量变化

给药期间，各用药组裸小鼠精神状况良好，遇刺激反应灵敏，饮食饮水量与对照组无明显差别。对照组裸小鼠体质量变化幅度小，化铁丸低、中、高剂量组裸小鼠体质量升幅高于对照组，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组裸小鼠体质量比较（±s，g）

表1 各组裸小鼠体质量比较（±s，g）

组别 只数 1 d 5 d 9 d 13 d 17 d 21 d对照组 8 18.20±0.48 18.50±0.52 18.60±0.62 18.60±0.71 19.20±0.70 19.80±0.74化铁丸低剂量组 8 18.50±0.44 19.10±0.47 19.50±0.45 20.10±0.56 20.50±0.54 20.80±0.67化铁丸中剂量组 8 18.20±0.56 19.50±0.65 20.20±0.67 20.60±0.68 20.80±0.70 21.20±0.74化铁丸高剂量组 8 17.80±0.61 18.50±0.66 18.20±0.62 19.50±0.66 20.20±0.68 20.40±0.72

2.1.2 各组裸小鼠瘤体积变化

随时间推移各组裸小鼠瘤体积呈增长趋势。从第13天起，化铁丸低、中、高剂量组与对照组比较，移植瘤体积生长较慢，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；第21天时，化铁丸中剂量组肿瘤体积最小，对照组肿瘤体积最大，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2、图1。

图1 给药21 d后各组裸小鼠移植瘤离体图

表2 各组裸小鼠移植瘤体积比较（±s，mm3）

表2 各组裸小鼠移植瘤体积比较（±s，mm3）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 只数 1 d 5 d 9 d 13 d 17 d 21 d对照组 8 143.6±8.9 352.6±34.6 652.3±40.2 878.1±52.1 1125.6±71.2 1425.6±92.5化铁丸低剂量组 8 141.5±10.2 235.5±26.4 490.5±33.5 675.5±44.2* 894.1±64.5* 925.6±77.8*化铁丸中剂量组 8 138.3±7.6 209.5±21.2 416.3±28.6 546.5±39.4** 757.6±48.7** 812.5±69.5**化铁丸高剂量组 8 136.8±9.4 223.5±22.5 565.8±38.5 725.6±48.7* 856.9±59.6* 1025.6±80.3*

与对照组比较，各用药组裸小鼠移植瘤瘤重显著减轻，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；化铁丸低、中、高剂量组的抑瘤率分别为36.0%、44.0%、32.1%，说明化铁丸能够抑制结肠癌增长且中剂量组效果最好。见表3。

表3 各组裸小鼠抑瘤率比较

2.2 化铁丸中剂量组与对照组微生物变化

由于中剂量化铁丸相当于临床人体所使用剂量，且抑瘤效果最好，故选取化铁丸中剂量组裸小鼠粪便微生物与对照组裸小鼠微生物进行以下分析。

2.2.1 Alpha多样性

本研究采用Observed、Chao1指数评估菌群OTU数量，Shannon指数评估菌群多样性。Observed、Chao1指数越高，菌群丰度越高；Shannon值越大，菌群多样性越高。两组中Observed、Chao1指数中位数具有显著性差异，且化铁丸中剂量组菌群丰度明显高于对照组菌群（P＜0.05）；Shannon指数中位数在两组中有明显差异，且化铁丸中剂量组菌群多样性明显高于对照组（P＜0.05）。见图2。

图2 对照组与化铁丸中剂量组粪便菌群Alpha多样性箱型图

2.2.2 β多样性分析

β多样性分析包括PCoA和PCA分析。红色点与蓝色点距离越接近则粪便菌群物种间的结构组成越相似，距离越远表明菌群物种间结构组成差异越大。通过分析发现，PC1为22.88%、PC2为13.1%时，化铁丸中剂量组与对照组样本结构存在差异，提示两组间肠道菌群明显存在差异。说明中剂量化铁丸可使肠道菌群组成结构发生改变。

2.2.3 组间微生物种类及其相对丰度分析

对微生物门水平的鉴定结果显示菌群主要包括了5个菌门，包括拟杆菌门、厚壁菌门、Patescibacteria门、变形菌门、放线菌门，其中拟杆菌门和厚壁菌门占比超过90%，且与对照组比较，化铁丸中剂量组的拟杆菌门、变形菌门丰度升高，厚壁菌门的丰度、Patescibacteria菌门、放线菌门降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4a。此外，化铁丸中剂量组和对照组有19个属水平上的细菌差异具有统计学意义（P＜0.05），见图4b。与对照组比较，化铁丸中剂量组可以增加Muribaculaceae_norank、毛螺杆菌科LachnospiraceaeNK4A136group、瘤胃球菌科RuminococcaceaeUCG-014、毛螺菌科Lachnospiraceae_uncultured、瘤胃梭菌属Ruminiclostridium、理研菌科Rikenella、Ruminiclostridium9、脱硫弧菌属Desulfovibrio、Muribaculum的丰度，减少乳杆菌Lactobacillus、Odoribacter、Alistipes、CandidatusSaccharimona、瘤胃球菌科Ruminococcaceae_uncultured、拟杆菌属、普雷沃氏菌科PrevotellaceaeUCG-001、肠杆菌属Enterorhabdus、ClostridialesvadinBB60group_norank的丰度。

图4 对照组与化铁丸中剂量组间物种差异分析

2.2.4 LEfSe差异物种分析

为了确定具有统计学意义的生物标志物、揭示组内的优势微生物，采用LEfSe软件进行差异性分析。图5a为聚类树，红色区域和绿色区域表示不同分组，树枝中红色节点表示在红色组别中起到重要作用的微生物类群，绿色节点表示在绿色组别中起到重要作用的微生物类群，黄色节点表示在两组中均没有起到重要作用的微生物类群，圆圈的直径越大物种丰度最高。图5b用线性判别分析效应大小，绘制LDA评分柱状图。LDA得分＞2时，其绝对值越大表示该物种对两组差异影响越大，红色代表在对照组显著富集的物种，绿色代表在化铁丸中剂量组中显著富集的物种。

图3 对照组与化铁丸中剂量组粪便菌群β多样性分析

图5 对照组与化铁丸中剂量组间LEfSe差异物种分析图

研究发现差异显著的菌种中，化铁丸中剂量组中梭菌目Clostridiales、梭菌纲Clostridia、毛螺菌科Lachnospiraceae_FCS020_group、瘤胃球菌属Ruminococcaceae_NK4A214_group、Ruminiclostridium_5、Lachnoclostridium、Parasutterella的相对丰度较高；肠杆菌属Enterobacter、乳酸菌目Lactobacillales、乳酸杆菌科Lactobacillaceae、杆菌纲Bacilli、乳酸杆菌属Lactobacillus的相对丰度较低。

3 讨论

中医认为结肠癌是因人体正气不足、阴阳失调，导致血瘀、痰凝、湿热等邪毒交结于肠道所形成的肿瘤。《医宗必读》中说：“积之成也，正气不足，而后邪气踞之”。《本草新篇》载威灵仙：“消肠中久积痰涎，除腹内癖气块。”楮实子具有“壮筋骨、助阳气、补虚劳、健腰膝”（《本草求真》）的功效。两者一攻一补，一刚一柔，相得益彰，专治癥瘕肿块，故云“化铁”。近年来研究证明威灵仙提取物多糖对舌鳞癌Tca-8113细胞具有抑制作用［13］；威灵仙提取物威灵仙总皂苷（CCS）对小鼠移植性肿瘤S180、HepA、P388均有显著的抑制作用［14］；楮实子总生物碱浓度达到60 mg/kg时对小鼠S180实体瘤、H22实体瘤和ESC实体瘤抑制作用最大，抑瘤率为40%［15］。

本研究显示，化铁丸具有明显抑瘤效果，其中中剂量组的效果最好，肿瘤抑制率为44.0%，低剂量组为36.0%，高剂量组为32.1%。用药期间对裸小鼠的体质量及正常活动无显著影响，说明化铁丸无明显不良反应。

本研究显示化铁丸中剂量组与对照组肠道微生物的优势菌是厚壁菌门和拟杆菌门，占比超过90%，其次是Patescibacteria门、变形菌门、放线菌门等，这与其他研究基本一致［16-17］。粪便微生物多样性分析显示，相比于对照组，化铁丸中剂量组可以提高肠道菌群的丰度和多样性。LEfSe差异物种分析显示，中剂量化铁丸可以降低肠杆菌丰度。肠杆菌属机会致病菌，部分肠杆菌如肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠产毒性大肠杆菌（ETEC）可以诱导肠道内炎症反应，促进肠癌发生［18-19］；另一方面，可以产生基因毒性物质，破坏正常肠道细胞中的脱氧核糖核酸（DNA）分子，使基因发生突变，导致肿瘤发生［20-24］。中剂量化铁丸明显增加梭菌目Clostridiales的作用，研究显示Clostridiales可抑制肠道内有害菌和腐败菌的生长、繁殖，纠正肠道菌群紊乱，产生的胞外可溶性多聚糖能完全抑制肿瘤生长［25-26］。除梭菌目外，中剂量化铁丸还增加了毛螺菌科Lachnospiraceae_FCS020_group、瘤胃球菌属Ruminococcaceae_NK4A214_group，均可产生丁酸盐。丁酸盐属于短链脂肪酸，是维持能量稳态所必需的，丁酸不仅可以抑制丙酮酸脱氢酶合成、降低糖酵解能力、抑制肿瘤细胞能量供应，还可促进肿瘤细胞凋亡，降低炎症因子的表达，抑制结肠炎，阻止肠癌发生［27-31］。故推测化铁丸可能通过提高有益菌的丰度，促进肿瘤细胞凋亡，最终抑制肠癌发展。

本研究通过体外验证实验发现，化铁丸可能通过提高裸小鼠肠道菌群的丰度及多样性，提高Clostridiales菌丰度，抑制条件致病菌Enterobacter杆菌的丰度，抑制结肠癌发展。由于本实验样本量小，没有通过无菌裸小鼠对差异菌进行验证，结果在一定程度上存在偏倚，这也是团队下一步要解决的问题。