HPLC-DAD 法同时测定银翘解毒丸中7 种成分的含量*

李 霞 易徐航 张钰祺

（萍乡市食品药品检验所，江西 萍乡 337000）

银翘解毒丸由清代医学家吴鞠通所著《温病条辨》中的银翘散演变而来，作为风热感冒的一种常用首选复方制剂，具有辛凉解表、清热解毒的功效。君药金银花-连翘作为清热解毒经典药对，具有抗病毒、抗菌、抗内毒素及免疫调节等作用，特别是抗病毒作用效果更佳[1]。金银花主要有效成分绿原酸据报道，其具有抗菌抗炎等药理作用[2]，木犀草苷具有降血脂、抗病毒等作用，同时木犀草苷是区别金银花与山银花、忍冬藤的主要特征成分，具有较强的呼吸道杀菌作用。连翘的主要活性成分连翘苷和连翘酯苷A，二者含量已被《中华人民共和国药典》2020 年版一部收载作为重要检测指标来评价药材质量优劣。臣药牛蒡子清热利咽喉，同时疏散风热，活性成分牛蒡苷具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗菌等多种生物活性[3]。使药甘草调和诸药，并与桔梗合用增强解毒利咽散结之功效，常以甘草苷及甘草酸作为指标成分来测定含量。

银翘解毒丸现行的质量标准为WS3-B-3693-98（蜜丸）、WS3-3693-98-1（小蜜丸和水蜜丸）、WS3-B-2782-97（浓缩丸）以及《中华人民共和国药典》（浓缩蜜丸）2020年版一部[4]。标准中主要通过显微鉴别，薄层色谱定性检测其中多味药材，浓缩蜜丸质量标准中收载了金银花中绿原酸的含量检测项目，但检测成分单一，不能从整体把控制剂的质量。对其质量控制研究的报道，主要集中在以HPLC 单波长检测金银花、连翘、牛蒡子、甘草中一两味药材指标成分的检测[5-8]。中药成分复杂多样，建立多指标成分进行含量测定显得尤其重要。本研究采用HPLC-DAD 法同时测定银翘解毒丸中7种活性成分含量，主要目的是有效控制制剂质量以及临床用药疗效。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪（型号：1200 型）-二极管阵列检测器（安捷伦），CPA225D 十万分之一电子分析天平（赛多利斯），ME-204 万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多），KQ-100DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），纯水仪（普力菲尔）。

1.2 试药 乙腈（赛默飞世尔科技）、磷酸（科密欧化学试剂有限公司）均为色谱级，甲醇（湖南汇虹试剂有限公司，批号为2011125.3），水为UP 级。绿原酸（批号为PF200705-11，纯度为99.48%），连翘酯苷A（批号为PF200719-02，纯度为99.89%），甘草苷（批号为PF200318-04，纯度为98.84%），木犀草苷（批号PF200517-08，纯度为98.20%），连翘苷（批号为PR200603-11，纯度为98.47%），牛蒡苷（批号为PF200907-02，纯度为98.15%），甘草酸铵（批号为RJ200104-16，纯度为98.63%），以上7 种对照品均由Sanford Chemicals 提供。

阴性药材均购自市场，均经萍乡市食品药品检验所药品室易徐航鉴定为正品。银翘解毒丸为市售产品，18 批样品信息见表1。

表1 18 批银翘解毒丸样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用色谱柱Agilent 5TC-C18（2）250 mm×4.6 mm；流动相A（乙腈）：B（0.3%磷酸），梯度洗脱（0～10 min，10%→20%A；10～20 min，20%→20%A；20～30 min，20%→30%A；30～60 min，30%→100%A；60～65 min，100%→10%A）；柱温：30 ℃；检测波长：230 nm，340 nm；进样体积：10 μL；流速：1 mL·min-1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取绿原酸对照品11.64 mg、连翘酯苷A 对照品11.17 mg、甘草苷对照品9.38 mg、木犀草苷对照品8.83 mg、连翘苷对照品13.01 mg、牛蒡苷对照品12.45 mg、甘草酸铵对照品10.54 mg 分别置于10 mL 量瓶中，制成对照品贮备液，用50%甲醇溶液溶解稀释制成绿原酸、连翘酯苷A、甘草苷、木犀草苷、连翘苷、牛蒡苷及甘草酸（甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207）的质量浓度分别为0.0232、0.0223、0.0185、0.0173、0.0256、0.0244、0.1018 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2 样品溶液 取水蜜丸研碎（蜜丸剪碎），精密称定约1.2 g，精密加入50%甲醇50 mL 溶解并稀释，加热回流30 min，静置放冷后用50%甲醇补足重量，混合均匀后过滤取续滤液即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按工艺方法制备缺金银花、连翘、牛蒡子、甘草阴性样品，按样品溶液制备方法制备成缺金银花、连翘、牛蒡子、甘草的阴性样品溶液。见图1。

图1 银翘解毒丸中7 种成分HPLC 色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密量取各对照品贮备液制成质量浓度绿原酸为11.6 μg·mL-1、连翘酯苷A 为11.2 μg·mL-1、甘草苷为1.9 μg·mL-1、木犀草苷为1.7 μg·mL-1、连翘苷为5.1 μg·mL-1、牛蒡苷为12.2 μg·mL-1及甘草酸铵为10.4 μg·mL-1的混合溶液。分别精密量取1、2、4、8、12、16、20 μL 注入液相色谱仪，测定混合对照品的峰面积，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线并计算得线性回归方程。见表2。

2.3.2 检测限与定量限 用对照品贮备液进行逐级稀释测定检测限与定量限，以3 倍信噪比测得检测限，以10 倍信噪比测得定量限，各成分检测限与定量限。见表2。

表2 银翘解毒丸中7 种成分线性曲线、检测限和定量限

2.3.3 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，注入色谱仪，连续进样5 次，结果绿原酸、连翘酯苷A、甘草苷、木犀草苷、连翘苷、牛蒡苷及甘草酸铵峰面积的相对标准差（Relative standard deviation，RSD）%分别为0.19%、0.19%、0.19%、0.16%、0.17%、0.46%、0.12%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 精密吸取S2 供试品溶液分别于0、2、8、12、24 h 时进样10 μL，注入色谱仪，测定峰面积，结果样品在24 h 内稳定性良好，绿原酸、连翘酯苷A、甘草苷、木犀草苷、连翘苷、牛蒡苷及甘草酸铵峰面积的RSD%分别为0.40%、1.22%、0.33%、1.69%、0.58%、2.09%、2.45%。

2.3.5 重复性试验 取S2 样品6 份，按2.2.2 方法制备溶液，每份连续测定3 次，测定绿原酸、连翘酯苷A、甘草苷、木犀草苷、连翘苷、牛蒡苷及甘草酸的平均含量分别为0.5363 mg·g-1、3.7127 mg·g-1、0.1431 mg·g-1、0.1114 mg·g-1、1.4897 mg·g-1、0.3873 mg·g-1、0.6124 mg·g-1，RSD%分别为1.48%、0.87%、2.05%、2.26%、1.40%、1.80%、2.95%，结果表明本法重现性良好。

2.3.6 加样回收试验 取已测得含量的S2 样品6 份，每份精密称取约0.5 g，精密加入绿原酸0.2316 mg、连翘酯苷1.1158 mg、甘草苷0.1854 mg、木犀草苷0.1734 mg、连翘苷0.6405 mg、牛蒡苷0.2444 mg以及甘草酸0.3047 mg，按2.2.2 方法制备溶液，取10 μL 注入色谱仪，进行测定，计算回收率。结果绿原酸、连翘酯苷A、甘草苷、木犀草苷、连翘苷、牛蒡苷及甘草酸平均回收率分别为：97.6%、100.8%、98.7%、99.2%、101.7%、101.8%、96.6%，RSD%分别为2.69%、2.08%、2.52%、1.81%、2.09%、2.31%、1.12%。

2.3.7 样品含量测定 选取不同生产企业18 批样品，按样品溶液制备方法2.2.2 制备，各平行制备2 份样品溶液，按上述色谱条件进行测定，采用外标法计算各成分的含量，结果见表3。

由表3 可知，18 批银翘解毒丸中7 种成分的含量存在明显差异。同一生产企业生产的不同批次样品，7种成分含量大体相当，不同剂型、不同厂家样品差异性较大，以绿原酸、连翘酯苷A、牛蒡苷的含量差异最为明显。

表3 银翘解毒丸中7 种成分的含量测定结果 (mg·g-1，n=2)

3 讨论

3.1 提取方法的选择 对供试品溶液采取不同的处理方法（超声和加热回流），提取时间（超声10、30、60 min 与加热回流10、30、60 min）等进行考察，结果提取相同时间，加热回流的处理方法对指标成分的提取效果更好。加热回流30 min 各指标成分能提取完全，故选取加热回流30 min 作为供试品溶液的提取方法。

3.2 检测波长的选择 经过二极管阵列检测检测器（Diode Array Detector，DAD）对对照品溶液在150～450 nm 内进行紫外光谱扫描，并采集光谱图。绿原酸在240 nm 和327 nm 处有最大吸收，连翘酯苷在280 nm 和327 nm 处有最大吸收，甘草苷、连翘苷、牛蒡苷在230 nm 和280 nm 处均有最大吸收，木犀草苷在250 nm 和350 nm 处有最大吸收，甘草酸铵在250 nm 处有最大吸收，为提高实验方法的准确性和灵敏度，最终考虑选择在230 nm 波长下检测甘草苷、连翘苷、牛蒡苷及甘草酸，在340 nm 波长下检测绿原酸、连翘酯苷A、木犀草苷。

3.3 流动相的选择 考察了甲醇-0.1%磷酸，乙腈-0.1%磷酸，甲醇-0.3%磷酸，乙腈-0.3%磷酸4 种不同的流动相进行梯度洗脱，结果显示乙腈-0.3%磷酸为流动相洗脱效果最好，各色谱峰峰型，分离效果以及基线平稳度最好。故最终以乙腈-0.3%磷酸作为流动相。

4 小结

综上所述，本研究采用HPLC-DAD 法同时对银翘解毒丸中7 种成分进行含量测定，该方法具有简单可行、灵敏度高、稳定性强等优点，可用于整体全面控制该制剂的质量，以保证产品质量稳定和临床用药疗效。