LKB1/AMPK通路在糖尿病肥胖大鼠心肌损伤中的作用

李小鸾 王叶 李永桂 张玲明 杨历新

(青海省人民医院内分泌科，青海 西宁 810000)

糖尿病(DM)是一种以高血糖、高脂血症、胰岛素抵抗为主要表现的代谢综合征。近年来发病率逐渐上升，给患者和家庭带来沉重的负担〔1〕。我国DM发病以2型DM(T2DM)为主〔2〕，随着物质生活水平的极大提高，肥胖和超重人口不断增多，世界卫生组织《糖尿病全球报告》指出，超重或肥胖是T2DM的最强危险因素〔3,4〕。研究发现，机体长期处于高糖刺激下可引起糖脂代谢紊乱、氧化及炎症反应活化、心肌细胞肥大、纤维化，导致心血管疾病发生风险增加〔5〕。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)可以激活葡萄糖、脂肪酸相关能量代谢通路，而肝激酶(LK)B1作为AMPK的上游激酶，可以直接磷酸化AMPKα参与糖脂代谢〔6〕。目前已有研究发现通过调控LKB1/AMPK通路可以分别在肥胖〔7〕、DM〔8〕模型大鼠中改善糖脂代谢紊乱，降低氧化应激及炎症反应。但是尚无文献报道LKB1/AMPK通路在DM肥胖大鼠心肌损伤中的作用。本研究通过建立DM肥胖大鼠复合模型，探究LKB1/AMPK通路在DM肥胖大鼠心肌损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级SD雄性大鼠60只，体重(170±10)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号:SCXK(京)2016-0011。动物均严格按照动物饲养规则喂养，温度为24℃，湿度为50%，12 h明暗交替，自由饮水和摄食。

1.2主要试剂及仪器 链脲佐菌素(STZ,Sigma公司,S8050)；5-氨基咪唑-4-羧基酰胺核糖核苷(AICAR,CST,9944P)；大鼠三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CKMB)、糖化血红蛋白(HbA1c)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、空腹胰岛素(FINS)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号分别为A110-1、A111-1、A032-1、E006-1、A056-1、A001-3、A003-1、H203-1)；苏木素-伊红(HE)染色试剂、放射免疫沉淀(RIPA)裂解液和二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(碧云天生物科技公司，批号分别为C0105、P0013B、P0012S)；Masson试剂盒(北京索莱宝生物技术有限公司，G1345)；兔抗p-AMPKα(Thr172，bs-4002R)、兔抗AMPKα(bs-2771R)、兔抗p-LKB1(bs-3249R)、兔抗LKB1(bs-3948R)、兔抗p-乙酰辅酶A羧化酶(ACC，bs-3039R)、兔抗ACC(bs-11912R)、兔抗GAPDH(bs-0755R)、羊抗兔IgG(H+L)/HRP(bs-40295G)，购自北京博奥森生物科技有限公司；多功能酶标仪(iMark680，Bio-Rad公司)、荧光显微镜(日本Olympus公司)；Accu-Chek Active型罗氏活力血糖仪(罗氏血糖健康医护公司)；超高分辨率小动物彩色多普勒超声实时影像系统(Vevo 2100,加拿大VisualSonics公司)。

1.3动物模型复制及分组 大鼠适应性喂养1 w后，随机挑选15只为空白组，采用标准饲料喂养；其余45只大鼠以高脂高糖饲料喂养加STZ注射的方法复制DM肥胖模型〔9〕(饲料配方为：64.75%基础饲料+10%猪油+20%白砂糖+5%蛋白粉+0.05%维生素+0.2%矿物质)，喂养4 w后，按照体重高于空白组体重的10%为标准〔10〕，筛选出肥胖大鼠。将筛选出的肥胖大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素55 mg/kg(注射前大鼠禁食20 h)，3 d后尾尖处取血检测空腹血糖，若血糖含量>16.7 mmol/L，且大鼠出现多食多饮多尿的表现，提示DM肥胖大鼠模型构建成功；共筛选出30只模型成功大鼠，平均体重(445.63±35.26)g，平均空腹血糖(FPG，25.24±1.48)mmol/L用于后续实验。

将30只模型复制成功大鼠分为模型组和AMPK激活剂组，每组15只。AMPK激活剂组腹腔注射AICAR，剂量为100 mg/(kg·d)〔11〕，空白组和模型组腹腔注射等体积灭菌后的生理盐水，连续5 d。5 d后进行取材和相关指标的检测。

1.4取材及处理

1.4.1大鼠体重变化及Lee指数 实验期间每周称大鼠体质量并记录，称重前大鼠禁食过夜，末次称重后经2%戊巴比妥钠(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，测体长(鼻尖至肛门的距离)，计算Lee指数。

1.4.2左心室功能检测 末次注射AICAR 2 h后，大鼠麻醉后，采用超高分辨率小动物超声影像系统测量大鼠左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、射血分数(EF)，短轴缩短率(FS)。

1.4.3血糖、FINS水平测定 末次注射AICAR 2 h后，采集尾末梢毛细血管全血(取血前禁食8 h)，血糖仪检测FPG水平，腹主动脉取血，离心分离血清，检测大鼠FINS、HbA1c水平，计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。HOMA-IR=(FPG×FINS)/22.5。

1.4.4血清TC、TG、MDA、SOD、CKMB、CK水平 生化法检测血清TC、TG、MDA及SOD活性，CKMB、CK水平，根据试剂盒说明书的操作方法测定。

1.4.5心肌HE染色、Masson染色 取血后，取出大鼠完整心脏，切取相同部位的心脏组织，4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，连续切3 μm薄片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱苯1 min，蒸馏水冲洗。常规HE、Masson染色，高倍光镜下观察心脏组织形态变化。

1.4.6Western印迹检测心肌组织中相关蛋白的表达 采用Western印迹对LKB1、AMPKα、p-AMPKα(Thr172)、ACC及p-ACC蛋白表达进行测定。20 μg总蛋白配制成上样体系，100℃煮沸5 min。将样品加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中，浓缩胶90 V，分离胶120 V，恒压电泳。采用湿式转膜法将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h后,加入相应的一抗(LKB1、AMPKα、p-AMPKα、ACC及p-ACC,按1∶1 000的比例稀释；GAPDH,1∶2 000稀释)，4℃孵育过夜。TBST清洗后，加入适当浓度的二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h。ECL发光液A、B等量混合后滴加到膜上显色。采用目的蛋白条带与相应GAPDH的光密度值的比值作为其蛋白的表达量。

1.5统计学方法 采用SPSS22.0软件进行t检验、方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1大鼠体重变化及Lee指数 造模前大鼠体重各组间差异无统计学意义(P>0.05)，造模后，与空白组相比，模型组和AMPK激活剂组大鼠体重显著增加(P<0.05)；腹腔注射AICAR 5 d后，与空白组比较，模型组和AMPK激活剂组大鼠体重、Lee指数显著增加(P<0.05)；与模型组相比，AMPK激活剂组大鼠体重、Lee指数均有所降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 DM肥胖模型大鼠体重变化

2.23组左心室功能相关参数 与空白组相比，模型组和AMPK激活剂组LVESD、LVEDD显著增大，EF、FS显著下降(P<0.05)；与模型组相比，AMPK激活剂组LVESD、LVEDD明显下降，EF、FS明显升高(P<0.05)。见表2。

2.33组血糖、FINS水平 与空白组相比，模型组和AMPK激活剂组FPG、FINS、HOMA-IR、HbA1c明显升高(P<0.05)；与模型组相比，AMPK激活剂组大鼠FPG、FINS、HOMA-IR、HbA1c明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 3组心功能、血糖及胰岛素水平比较

2.43组血清TC、TG、CKMB、CK水平 与空白组相比，模型组和AMPK激活剂组血清TG、TC、CKMB、CK水平显著升高(P<0.05)；与模型组相比，AMPK激活剂组血清TG、TC、CKMB、CK水平明显降低(P<0.05)。见表3。

2.53组血清MDA和SOD水平 与空白组相比，模型组和AMPK激活剂组MDA含量明显增多，SOD含量明显减少(P<0.05)；与模型组相比，AMPK激活剂组MDA含量明显减少，SOD含量明显增多(P<0.05)。见表3。

表3 3组血清TC、TG、HbA1c、CKMB、CK、MDA及SOD水平比较

2.63组心肌HE染色、Masson染色 空白组的心肌细胞形态规则、排列整齐、肌纤维完整，未见心肌细胞水肿、坏死；与空白组相比，模型组心肌细胞形态不规则、排列紊乱、局部肌纤维横纹消失，可见心肌细胞水肿，纤维增生明显，少量心肌细胞变性、坏死；与模型组相比，AMPK激活剂组心肌细胞水肿减轻，心肌纤维排列较为整齐，心肌纤维增生情况明显好转。见图1。

图1 3组心脏组织形态学改变(×400)

2.7Western印迹检测心肌组织中LKB1/AMPKα通路相关蛋白的表达 与空白组相比，模型组和AMPK激活剂组心肌组织p-LKB1/LKB1、p-AMPKα/AMPKα、p-ACC蛋白表达显著降低，ACC蛋白表达显著升高(P<0.05)；与模型组相比，AMPK激活剂组p-LKB1/LKB1、p-AMPKα/AMPKα、p-ACC蛋白的表达明显升高，ACC蛋白表达明显降低(P<0.05)。见表4、图2。

表4 3组心肌组织中LKB1、AMPKα相关蛋白的表达

图2 3组心肌组织中LKB1、AMPK相关蛋白表达

3 讨 论

据报道，肥胖人群患DM的概率是普通人群的2～3倍〔12〕，而且DM肥胖患者常伴有血脂代谢异常、胰岛素抵抗、糖耐量异常等，可引起心肌细胞损伤，增加心血管病变的风险，严重危害人民的健康和生命〔13〕。而目前关于DM肥胖引起心肌损伤的机制尚不明确，临床缺乏有效的治疗方法和药物。

动物模型的构建是研究的基础，目前关于DM肥胖动物模型的制备尚无明确的方法。肥胖动物模型的制备常选用高脂膳食喂养，而DM动物的制备方法较多，STZ诱导是较理想的方法。常用的有STZ一次性大剂量注射、STZ多次小剂量注射、STZ加高脂饮食诱导；给药途径有皮下、尾静脉、舌下静脉、腹腔，文献报道也不一。考虑到多次小剂量注射误差较大，而且会增加动物感染的风险，静脉注射不易操作，易损耗药物；故本研究参照文献〔9,14,15〕选择高脂高糖饮食喂养4 w后，辅以STZ腹腔注射构建DM肥胖大鼠模型。结果提示DM肥胖模型大鼠心腔扩大，心脏泵血量显著降低，不能满足机体的需要，心脏泵血功能衰竭。CK、CKMB是特异性心肌酶，被广泛认为是心肌损伤的重要标志物，其升高程度与心肌损伤程度密切相关。本研究结果提示，DM肥胖大鼠出现严重的心肌损伤。

AMPK是脂代谢的关键激酶，活化的AMPK可以使其下游蛋白ACC磷酸化，抑制ACC的活性，抑制脂肪、TC、TG的合成，改善糖脂代谢〔16〕。LKB1是AMPK上游激酶，可以在多种细胞内使AMPKα亚单位上的苏氨酸172位磷酸化，从而激活AMPK，减少机体胆固醇和脂肪酸的生成，减轻脂肪酸诱导的氧化应激损伤〔17〕，进而调节机体的代谢及细胞增殖等〔18〕。高血糖是DM心肌损伤的独立危险因素，当心肌细胞长期处于高血糖状态下，可诱导活性氧的产生〔19〕，升高MDA水平，降低谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)活性，下调SOD蛋白和mRNA表达，诱导心肌细胞凋亡〔20,21〕。郭先中等〔22〕研究发现二甲双胍可以激活LKB1/AMPK信号通路，降低TC、TG、MDA、TNF-α、IL-6水平和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3蛋白表达，升高SOD水平，改善大鼠糖脂代谢，降低氧化应激和炎症反应，保护DM心肌病模型大鼠的心肌损伤；Hu等〔23〕发现白藜芦醇可以通过激活LKB1-AMPK信号通路来抑制链脲佐菌素引起的高血糖症引起的氧化应激反应，改善DM小鼠的内皮功能障碍。AICAR是一种腺苷类似物，能够模拟AMP功能，特异性激活AMPK〔24〕。本研究结果提示，DM肥胖模型大鼠出现脂代谢紊乱和氧化应激反应。DM肥胖大鼠存在LKB1/AMPK信号通路受到抑制的现象，出现糖脂代谢紊乱和氧化应激反应，心肌细胞严重受损；激活LKB1/AMPK信号通路可改善糖脂代谢紊乱和氧化应激反应，对DM肥胖大鼠心肌损伤具有保护作用。