基于网络药理学的淫羊藿治疗糖尿病心肌病的机制研究

梁金花，林俊颜，李春河，罗苑苑，陈日垦，郑珍珍

1.广东医科大学附属第二医院内分泌科，广东 湛江 524000；

2.国家呼吸医学中心、呼吸疾病国家重点实验室、广州医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科、广州呼吸健康研究院，广东 广州 510120；

3.广州中医药大学第一附属医院重症医学科，广东 广州 510120；

4.广东医科大学附属第二医院呼吸科，广东 湛江 524000

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)主要由糖尿病(diabetesmellitus，DM)引起，DM长期影响导致心脏初始舒张功能和晚期收缩功能障碍，与高血压和冠状动脉疾病无关[1]。DM是一个主要的全球健康问题，估计全世界有3.66亿人受到影响[2]，并且会导致心力衰竭(HF)的发生，事实上，高血糖、高脂血症和胰岛素信号传导中断可能与DCM的发展相一致。DCM包括一系列心脏异常，包括心脏肥大、心肌纤维化、糖尿病微血管病、舒张和收缩性心脏功能障碍[3]。心肌细胞内脂肪酸代谢升高、脂质沉积和葡萄糖代谢受抑制是DCM的主要病理特征[4]。DCM患者胰岛素抵抗会导致代谢紊乱，从而上调与游离脂肪酸摄取和氧化相关的蛋白质表达。增加的脂肪酸β-氧化产生过量的活性氧(ROS)并导致心脏氧化应激，长期氧化应激促进心脏纤维化、心肌细胞肥大和心功能不全，从而加剧DCM的发展[5-6]。

淫羊藿[Epimedium(yinyanghuo)]别称仙灵脾，最早记载于《神农本草经》，其化学成分包括4大类，分别为生物碱、木脂素、多糖以及黄酮、多糖与黄酮类化合物的生物活性相对较强，是传统的温肾壮阳中药，具有补肾壮阳、祛风湿、强筋骨等功效，用于治疗高血压、冠心病、骨质疏松、更年期综合征、阳痿、半身不遂、四肢麻木等，淫羊藿还常与其他中药联合用于治疗DM及其并发症[7-8]。近年来，为了充分发挥淫羊藿的作用，医学领域对其进行了大量的研究，并在有关研究不断推进的过程中取得了诸多研究成果[9-11]。国内学者研究显示淫羊藿总黄酮可能通过降低血糖、抗氧化等途径对DM小鼠血管内皮损伤起到保护作用[12]。其中淫羊藿苷(Icariin)是一种从淫羊藿中分离出来的黄酮类化合物，是淫羊藿中的主要活性成分[13]。有研究揭示了Icariin对各种疾病状况的治疗作用，包括心血管疾病[14-16]和DM诱发的疾病[17]。Icariin通过多种途径如抗氧化、抗炎和脂质调节活性发挥作用[14]，研究显示淫羊藿苷通过增加线粒体中sirtuin-1的表达而产生保护心肌细胞免受氧化应激损伤的作用[18]。然而淫羊藿中仍有很多成分如检测淫羊藿次苷Ⅱ(ICAⅡ)、朝藿定等可能会对心血管疾病发挥作用，如ICAⅡ能够上调miR-181c，激活下游的相关的信号通路，从而恢复血管内皮细胞功能[19]，总体来说目前其他成分的研究还很欠缺。本研究通过网络药理学分析淫羊藿治疗DCM的作用，在基于计算机软件构建网络后，确定了该药用植物的作用机制，希望为未来开发淫羊藿相关有效成分提供理论参考。

1 资料与方法

1.1 获取淫羊藿的主要有效活性成分选择TCMSP平台检索淫羊藿所含有的化学成分，再以化合物的药动力学参数中的类药性(drug-likeness，DL)≥0.18，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，caco-2 permeability≥-0.4和half-life≥3 h为筛选标准，筛选出淫羊藿中主要的有效活性成分。

1.2 有效活性成分的靶点预测以活性成分为关键词，通过PubChem进行检索，确定淫羊藿的结构信息，接下来在Swiss Target Prediction平台中检索有关结构信息，确定研究所需的靶点信息。

1.3 DCM相关靶点预测选择GeneCards平台以“diabetic cardiomyopathy”为检索词查找DCM相关靶点信息。将淫羊藿有效活性成分和DCM的有关靶点信息进行对比分析，确定淫羊藿治疗DCM的作用靶点。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建在String平台中导入上一步骤获得的靶点信息，使用Multiple Proteins，将Organism设置成Homo Sapiens，接下来向Cytoscape version 3.8.2工具中导入获得的信息，构建网络并进行分析，最后获得研究所需的PPI关系图。

1.5 靶点GO富集及KEGG通路注释分析用R语言对淫羊藿与DCM的共作靶点进行分析，获得GO富集分析所需的气泡图以及条形图，最后通过转换获得相应的原始基因靶点。

1.6 靶点KEGG通路富集分析及KEGG关系网络构建通过转换使ID成为相应的文本文件，基于R语言工具处理获得文本文件、气泡图与条形图。在Cytoscape3.8.2工具中导入通过perl处理后得到的KEGG文件，对KEGG关系网进行绘制。

2 结果

2.1 淫羊藿主要有效活性成分与潜在靶点的筛选结果基于数据库筛选出淫羊藿中主要的有效活性成分有17个，见表1，经过SwissTargetPrediction数据库预测并构建成分靶点集，得到淫羊藿潜在活性成分靶点551个。

表1 淫羊藿主要有效活性成分Table1 Main activeingredients of Epimedium

2.2 DCM潜在靶点信息基于GeneCards可以得到330个DCM的靶点基因，将已经获得的淫羊藿中有效活性成分作用的靶点基因取交集，可获得两者的共同靶点有58个(图1)。

图1 淫羊藿与糖尿病心肌病共同靶点韦恩图Figure 1 Venn diagram of the common target of Epimedium and diabetic cardiomyopathy

2.3 淫羊藿主要有效活性成分-核心靶点网络本研究通过Cytoscape 3.8.2工具绘制的靶点图(图2)，图中绿色、红色、棕黄色与蓝色部分分别对应的是淫羊藿、DCM、活性成分与靶点。节点的重要程度与连线的密集程度间具有正相关的关系，也就是如连线较少，那么节点的重要性便相对较差，相应的如连线较多，那么节点的重要程度便相对较高。在STRING中输入得到的58个靶点信息，可以构建出PPI网络图(图3)，通过R语言提取出中度值居于前30位的基因(图4)。

图2 淫羊藿有效活性成分-核心靶点网络Figure 2 Theeffectiveactiveingredient-Hub target network of Epimedium

图3 淫羊藿与糖尿病心肌病靶点PPl网络Figure3 PPl network of Epimedium target and diabetic cardiomyopathy target

图4 PPI的核心基因Figure4 Hub genesof PPI

2.4 淫羊藿-DCM相关靶点GO富集分析使用R语言对淫羊藿-DCM相关靶点进行GO富集分析。经R语言运行后总共得到74个功能，以前20作为分界，可得到如下两图所示的条形图(图5)与气泡图(图6)。如富集较少，那么图形的颜色便相对较为趋近于蓝色，如富集较为显著，那么图形的颜色便较为趋近于红色，图像的横坐标代表的是富集数量。GO富集分析描述了淫羊藿治疗DCM的靶点参与protein serine/threonine kinase activity、insulin receptor substrate binding、protein kinase C activity和calcium-dependent protein kinase Cactivity等。

图5 GO富集条形图Figure5 GO enrichment bar graph

图6 GO富集气泡图Figure 6 GO enrichment bubblediagram

2.5 淫羊藿-DCM相关靶点KEGG通路富集分析KEGG通路富集分析及KEGG关系网络构建选择R语言工具，通过该工具进行处理后，得到的通路数量为159条，根据显著性的大小选取居于前20位的通路，并绘制相应的条形与气泡图(图7、图8)。图左侧代表通路名称，横坐标代表靶点的数量，如果靶点数量越少，图形的颜色便趋近蓝色，靶点数量越多，图形的颜色便趋近红色。图9为进行富集时居于前20位的基因和KEGG通路间的网络图，连线是指相互链接，内圈与外圈的圆形分别代表的是基因与通路，如图形的颜色越深，且面积较大，说明相互关联的数量也越多，通过观察分析该图不难发现KEGG通路与基因之间的网络图中关联数量较多的基因主要有蛋白激酶B1(AKT1)、磷酸肌醇3激酶催化亚基β(PIK3CB)、磷酸肌醇3激酶催化亚基α(PIK3CA)、磷酸肌醇3-激酶调节亚基1(PIK3R1)和磷酸肌醇3激酶催化亚基δ(PIK3CD)等。

图7 KEGG富集条形图Figure7 KEGG enrichment bar graph

图8 KEGG富集气泡图Figure8 KEGG enrichment bubblemap

图9 淫羊藿治疗糖尿病心肌病的KEGG关系网络Figure 9 KEGG network of Epimedium in the treatment of diabetic cardiomyopathy

3 讨论

DM有许多并发症，其对心肌的影响较严重[20-21]，DM并发症严重威胁着DM患者的生活质量[22]。DCM是DM的严重并发症之一，死亡率高，被描述为存在心肌功能障碍而没有任何其他常规心血管危险因素。DCM主要表现为心肌纤维化、心肌细胞肥大、细胞凋亡和代谢紊乱，最终导致心力衰竭[23-25]，尽管有研究从分子和细胞角度解释发病机制，可能涉及过度氧化应激、纤维化、细胞凋亡和高血糖引起的炎症，但仍有争议[26-27]。

近年来在治疗扩张型心肌病方面的选方用药表现出更加全面、多样与系统的特点[28]。通过淫羊藿中的主要成分淫羊藿苷及淫羊藿总黄酮等的有关动物实验能够发现，在治疗扩张型心肌病方面淫羊藿可以发挥良好的作用，不过与病机相关的研究相对较少[29-30]。本研究筛选出淫羊藿中主要的有效活性成分有槲皮苷(quercetin)、木樨草素(luteolin)、乙酸亚油醇酯(linoleyl acetate)、山奈酚(kaempferol)等17个，发现58个靶点对DCM产生作用，利用PPI处理后确定了前5位的靶标，分别为蛋白激酶1(AKT1)、肿瘤坏死因子(TNF)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、肿瘤蛋白p53(p53)和内皮型一氧化氮合成酶[NOS3(eNOS)]等，因此推测这5个靶标可能是淫羊藿治疗DCM的关键靶点。有研究发现AKT是信号转导分子，其介导的信号转导通路调节细胞分裂、分化、凋亡等活动[31]，而达格列净可上调AKT/酪氨酸激酶(JAK)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路减轻DCM[32]。肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)是一些主要的促炎细胞因子，参与糖尿病并发症的发生和发展[33]，一项研究评估了左心室舒张功能障碍的促炎细胞因子水平，这是DM引起左心室功能障碍的最早表现，其发现血浆IL-6和TNF-α水平升高[34]。研究显示二甲双胍改善2型DM引起的左心室损伤中纤维化和血脂异常的活性氧(ROS)-p53-胶原蛋白(collagen)轴，还有研究显示恢复细胞外调节蛋白激酶(ERK)/mTOR通路可预防DCM[35]，而淫羊藿能对Akt/mTOR起到抑制作用，同时还可以使p53激活[36]。Baumgardt等[37]发现通过BH4/eNOS/NO途径限制DCM和缺血/再灌注损伤，而Duan等[38]发现淫羊藿苷激活PI3K/AKT-eNOS通路可延缓内皮细胞衰老。

GO富集分析显示淫羊藿治疗DCM的预测靶点参与蛋白丝氨酸苏氨酸磷酸酶/苏氨酸激酶激活、胰岛素受体底物结合、蛋白激酶C激活和钙依赖蛋白激酶C激活等。KEGG富集通路分析显示淫羊藿治疗DCM的主要通路有糖尿病心肌病、HIF-1信号通路、糖尿病并发症中的晚期糖基化终产物(AGE)-晚期糖基化终产物受体(RAGE)信号通路、胰岛素抵抗、生长激素的合成、分泌和作用通路和内分泌阻抗通路等，这与PPI网络分析及GO富集分析结果相似。缺氧诱导因子-1(HIF-1)与DCM密切相关[39]，ROS和HIF1α依赖性IGFBP3上调阻断IGF1存活信号，从而介导高糖诱导的心肌细胞凋亡，而外源性硫化氢通过抑制信号转导及转录激活子3(STAT3)/HIF-1α通路可以防止高糖诱导的细胞凋亡和氧化应激[40]。相关研究发现AGE及其受体(RAGE)与DCM的发病机制有关，抑制RAGE/NF-κB信号通路和下游炎症因子的表达，对DM大鼠相关心血管并发症具有保护作用[41]。AGE及其与RAGE的相互作用促进细胞的增殖、ECM的积累和抑制细胞凋亡从而诱导血管重塑，AGE和RAGE相互作用产生的ROS调节细胞增殖、减弱细胞凋亡和收缩血管[42-43]，淫羊藿苷Ⅱ(ICAⅡ)和二甲双胍(MET)可降低空腹血糖(FPG)、血红蛋白A1c(HbA1c)和AGEs水平。ICAⅡ和MET还可能通过PI3K-AKT-mTOR通路增强信号传导，以减少平滑肌细胞线粒体自噬[44]。生长激素促分泌素(GHS)在内分泌、代谢和心血管研究领域开辟了许多新的视角，表明其可能在DM和DM并发症尤其是DCM中发挥治疗应用，其可调节巨噬细胞和脂肪细胞中的过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)，PPAR-γ是胰岛素致敏的重要调节剂。生长激素释放肽(Ghrelin)还通过激活PI3K/AKT和c-Jun N-末端激酶(JNK)抑制对β细胞显示出保护作用。在胰腺切除大鼠和链脲佐菌素治疗的新生大鼠中，酰化生长素释放肽(AG)和非酰化生长素释放肽(UAG)给药可降低葡萄糖水平并增加产生胰岛素的β细胞数量和胰岛素分泌，表明GHS在胰腺再生中可能发挥作用[41，45]。这些通路被激活可以促进细胞因子的分泌，其中最重要的包括TNF-α，这有助于炎症反应[46]，而这些细胞因子可以加速DCM的进展。

本研究以网络药理学为基础，针对淫羊藿治疗DCM的作用机制进行研究，结果表明淫羊藿可能利用多靶点、多成分、多通路抑制氧化应激、炎症反应、细胞自噬来改善DCM及心肌细胞氧化代谢功能，作用于AKT1、TNF、mTOR、TP53和NOS3(eNOS)等相关靶点。